[發(fā)明專利]蜱的抗凝血蛋白及其基因和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110008384.8
• 申請日: 2011-01-15
• 公開（公告）號: CN102153640A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 周金林;陶正國;高曉;周勇志;曹杰;張厚雙
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所;廣州立達爾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/63;C12N15/866;C12N5/10;A61K38/17;A61K48/00;A61P7/02
• 代理公司: 上海大邦律師事務所 31252
• 代理人: 周東萍

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2及其基因和應用。

背景技術

在生物進化過程中，哺乳動物形成了一個復雜的凝血系統來阻止血液的流失，而很多以血液為生的生物體內往往存在很多抗凝血蛋白以對抗宿主的凝血功能。蜱是一類以吸血為生的體外寄生蟲。與其他吸血節(jié)肢動物相比，蜱的吸血時間特別長，如硬蜱的吸血時間一般在10-14天(Sonenshine，1993)。蜱的長時間吸血過程，必然引起宿主一系列止血反應，如血管收縮、血小板凝集和血液凝固。為了進行持續(xù)的吸血，蜱必須克服宿主的止血反應，自從Waxman(1990)鑒定出第一個蜱的抗凝血分子以來，研究人員發(fā)現蜱的唾液腺在吸血過程中分泌產生多種抗凝血分子，如凝血酶抑制蛋白分子、凝血因子Xa(FXa)抑制蛋白分子和組織因子通路抑制蛋白分子(TFPI)等，已在美洲花蜱、變異革蜱、間突硬蜱、具尾扇頭蜱、微小牛蜱等多種國外優(yōu)勢蜱體內被發(fā)現(Maritz-Olivier，2007)。盡管已報道的蜱抗凝血分子多達20多種，但完全鑒定的還很少。從目前的結果分析，蜱抗凝血分子多數屬于Kunitz家族絲氨酸酶特異性抑制分子，特征性含有1個或2個KU結構功能域和高度保守的半胱氨酸殘基，在進化上可能來自同一祖先(Lai，2004)。

由于血栓引起的人心、腦血管疾病嚴重威脅著人類健康，目前可用的抗栓制劑有限，因此，抗栓藥物的研究一直是十分關注的領域(Bates?and?Weitz，2006)。根據水蛭(螞蝗)抗凝血分子合成的抗凝血多肽Hirudin已被應用于醫(yī)學臨床(Turk，2006；Bates?and?Weitz，2006)。在已經鑒定的蜱抗凝血分子中，有2個分子在動物模型實驗中具有抗血栓治療作用，其中1990年鑒定的TAP分子為凝血因子Xa(FXa)抑制劑，重組表達的TAP在多個動物模型上都顯示了良好的抗血栓作用，由于抗原性等原因目前還未能在人體臨床上使用(Bates?andWeitz，2006)，但利用TAP分子的結構和作用機制設計更小的、沒有抗原性的抗栓藥物，或者構建新型重組抗栓藥物分子正在研究并取得進展，例如，應用TAP功能區(qū)序列和錨定蛋白Annexin?V序列構建一個新的重組抗凝血蛋白分子，其抗血栓活性比單個錨定蛋白Annexin?V的活性提高10倍(Chen，2005)。另一個蜱抗凝血分子Ixolaris，是近年從間突硬蜱鑒定的分子，與人的組織通道抑制因子(TFPI)同源，抑制凝血因子VIIa/組織因子復合體，在大鼠模型中，顯示了很強的抗血栓作用(Monteiro，2005；Nazareth，2006)。這些研究表明，蜱的抗凝血分子可以開發(fā)為新型抗血栓藥物。

鐮形扇頭蜱(Rhipicephalus?haemaphysaloides)主要分布于南亞及中國南方，是中國優(yōu)勢蜱種之一，在牛、羊、狗、兔等多種動物吸血寄生。申請?zhí)枮?00910053692.5、公開號為CN101928710A的中國專利申請，公開了一種鐮形扇頭蜱的抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列和重組表達與應用。但是，目前仍缺乏能開發(fā)為新型抗血栓藥物的蜱抗凝血蛋白，關于鐮形扇頭蜱的其他抗凝血蛋白國內外尚沒有公開報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種蜱的抗凝血蛋白及其基因，該抗凝血蛋白為鐮形扇頭蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2，可用于制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑。

此外，還需要提供一種蜱抗凝血蛋白的重組表達方法及其在制備抗凝血藥物或抗凝血生物制劑中的應用。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現：

在本發(fā)明的一個方面，提供了一種蜱的抗凝血蛋白，所述抗凝血蛋白為鐮形扇頭蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2，具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種蜱的抗凝血蛋白基因，所述基因為鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Rhipilin-2基因，其包含：編碼SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述抗凝血蛋白基因具有SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白基因的重組載體。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述重組載體的細胞。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種蜱抗凝血蛋白的重組表達方法，包括以下步驟：

構建含鐮形扇頭蜱抗凝血蛋白Rhipilin-2編碼基因序列的真核表達重組載體；

將所述重組載體轉化至大腸桿菌細胞，篩選獲得重組桿狀病毒粒；