[發(fā)明專利]豬傳染性胃腸炎多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110008010.6
• 申請(qǐng)日: 2011-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN102586409A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭世民;趙良友;劉超男;高雪麗;呂曉萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 鄭世民
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務(wù)所 23118
• 代理人: 陳曉光

1.一種豬傳染性胃腸炎多重的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法，其特征是:所述的方法有八步，分別為豬傳染性胃腸炎病毒TGEV和豬流行性腹瀉病毒PEDV基因引物設(shè)計(jì)與合成、豬傳染性胃腸炎病毒TGEV和豬流行性腹瀉病毒PEDV多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR診斷方法的建立、二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR引物濃度優(yōu)化、二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR氯化鎂MgCl2濃度優(yōu)化、二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR三磷酸堿基脫氧核苷酸dNTP濃度優(yōu)化、二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR最佳退火溫度的確定、二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR敏感性試驗(yàn)、二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR特異性試驗(yàn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法，其特征是:所述的引物設(shè)計(jì)與合成；根據(jù)基因庫(kù)GenBank上已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV和豬流行性腹瀉病毒PEDV的纖突蛋白S蛋白基因序列，比較分析保守序列，按反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR引物設(shè)計(jì)原則，通過(guò)歐立格Oligo6.0及普來(lái)模Primer5.0軟件設(shè)計(jì)豬傳染性胃腸炎病毒TGEV和豬流行性腹瀉病毒PEDV基因引物；所述的?豬傳染性胃腸炎病毒TGEV和豬流行性腹瀉病毒PEDV二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR反應(yīng)體系：?建立如下二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR反應(yīng)體系，總體積為25μL:

超純水（ddH20）??????????????????????????????????????7.87μl

緩沖液（10×PCR?Buffer）?????????????????????????????5.0μl

三磷酸堿基脫氧核苷酸[dNTP?Mixture(2.5mmol/L)]????????4.0μl

P3（10μmol/L）???????????????????????????????????????0.5μl

P4（10μmol/L）???????????????????????????????????????0.5μl

P5（10μmol/L）???????????????????????????????????????0.5μl

P6（10μmol/L）???????????????????????????????????????0.5μl

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)?????2.0μl

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)???????2.0μl

氯化鎂[MgCl₂?(25mmol/L)?]?????????????????????????????2.0μl

聚合酶[rTaq?（5U/μl）]????????????????????????????????0.13μl

將二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR產(chǎn)物及陰性對(duì)照產(chǎn)物同脫氧核糖核酸分子量標(biāo)記物DL2000于1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)紫外檢測(cè)儀檢測(cè)并拍照;可以看出陰性對(duì)照無(wú)電泳帶；PEDV和TGEV混合cDNA中在500bp上下有兩條電泳帶，大小分別約為584bp和426bp，分別為PEDV和TGEV的特異片段電泳帶；TGEVcDNA中有一條大小約為426bp電泳帶，為TGEV的特異片段電泳帶；PEDVcDNA中有一條大小約為584bp電泳帶，為PEDV的特異片段電泳帶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胃腸炎多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法，其特征是:所述的二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR引物濃度優(yōu)化；試驗(yàn)確定的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV模板稀釋度，加入豬流行性腹瀉病毒PEDV滴定的引物濃度最佳量及不同濃度的豬傳染性胃腸炎病毒TGEV引物進(jìn)行二聯(lián)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR引物優(yōu)化;?引物濃度從8μmo1/L~10μmo1/L電泳帶均較亮，相比之下引物濃度在8μmo1/L時(shí)，目的片段條帶最為清晰，且完整性好，說(shuō)明其擴(kuò)增效好。