[發(fā)明專利]眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存及其培養(yǎng)擴(kuò)增方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110007514.6
• 申請(qǐng)日: 2011-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN102586180A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉擁軍;吳明遠(yuǎn);黃家學(xué);劉洋;施潔琦;張麗麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077;A01N1/02
• 代理公司: 北京匯信合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王維新;王秀麗

1.眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，其特征在于：

1)、在凈化工作臺(tái)下，將眼袋脂肪組織從無菌容器中移出，放入無菌器皿中；

2)、加入無菌的且含有抑菌劑的滲透壓為270-330mOsm/kg的磷酸鹽緩沖溶液，輕輕沖洗后，移出磷酸鹽緩沖溶液；

3)、用手術(shù)剪快速將組織剪碎，盡量剔除黃色部分，直至組織塊大小約2mm×2mm×2mm；

4)、再次加入磷酸鹽緩沖溶液重懸組織塊，200g-300g離心5分鐘，棄去上層磷酸鹽緩沖溶液，選取下層沉淀組織塊備用；

5)、取6孔-24孔培養(yǎng)板，每孔用眼科鑷植入一枚至多枚組織塊，用蓋玻片加壓蓋住，加入少量貼壁培養(yǎng)基至潤濕底面；

6)、按24孔板計(jì)算，每孔加入已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液0.3-0.5ml，在36-38℃1％-5％CO²條件下培養(yǎng)48h后，每孔再加入0.3-0.5ml已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，每3天半量換液一次；

7)、組織塊植入約3天，當(dāng)組織塊周圍可見有散在的長(zhǎng)梭形細(xì)胞時(shí)，每3天半量換液一次；

8)、至每孔培養(yǎng)的原代細(xì)胞增至70％～80％融合；

9)、移出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入1-1.5ml無菌磷酸鹽緩沖溶液，用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液輕柔的沖洗培養(yǎng)層，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；

10)、每孔加入0.2ml消化液，使充分浸潤后輕搖培養(yǎng)瓶，約1-3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入1ml完全培養(yǎng)基終止消化；

11)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，輕柔的沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；

12)、取300g，在4℃溫度條件下，離心5min后，棄去上清液；

13)、采用差速貼壁法，棄去30分鐘內(nèi)的貼壁細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，棄去1小時(shí)內(nèi)未貼壁的細(xì)胞；

14)、篩選出的貼壁細(xì)胞采用密度為1.073g/ml-1.077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法離心；

15)、將分層篩選出的細(xì)胞用10ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打混勻，傳入2個(gè)T75培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)足5ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)；

16)、傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至亞匯合狀態(tài)；

17)、使用含有7％-10％的二甲基亞砜組分的凍存液凍存脂肪間質(zhì)細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，其特征在于：抑菌劑為0.002％-0.01％的苯扎氯銨配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素20-100毫克；PBS的配方為稱取NaCl8g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O3.489g、KH₂PO₄0.2g，溶于900ml左右的三蒸水中，用HCl或NaOH調(diào)整PH值至7.3-7.4之間。