[發明專利]一種耐有機溶劑高活性脂肪酶產生菌及其所產脂肪酶的基因和應用

有效

• 申請號: 201110007349.4
• 申請日: 2011-01-14
• 公開（公告）號: CN102174432A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 何冰芳;王瑞強;姚長進;吳斌;柏中中
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/55;C12N9/16;C12P41/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術領域

本發明屬于微生物工程與酶工程技術領域，具體涉及一種耐有機溶劑脂肪酶產生菌，其耐有機溶劑脂肪酶的基因，以及該耐有機溶劑脂肪酶在有機相中催化拆分手性醇的應用。

技術背景

脂肪酶(EC3．1．1．3)是一種酯鍵水解酶，它可在油水界面催化長鏈甘油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸，在洗滌、制革、食品、生物化工、造紙、醫藥、環保等行業被廣泛應用。

脂肪酶在有機相中可以完成酯化、交換及轉酯等反應，并具有區域選擇性、立體選擇性、較高的穩定性，尤其是它的立體選擇催化特性，可以用于化學法難以進行的消旋化合物的拆分、不對稱合成等。近年來，國內外學者已經致力于應用脂肪酶在有機體系中實現手性化合物，尤其是藥物中間體的立體選擇性水解或拆分，如利用微生物脂肪酶可完成酮基布洛芬、反應停、心得安等手性藥物的立體選擇性水解或拆分。與傳統的化學方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反應條件溫和、節省能源、專一性強、副反應少、產品純度高、反應步驟簡單、不需手性源、產品成本低等優點。

脂肪酶在有機溶劑中容易變性或使酶活力下降，雖然國內外許多學者已經研究了不同方法來增加酶在有機溶劑中的穩定性，但其還是無法滿足工業化的需求。因此尋找天然耐有機溶劑的脂肪酶，使其在有機溶劑或含有機溶劑的環境中具有較高的催化活性，已成為脂肪酶研究領域的一個重要方向。

發明內容

本發明的目的是提供一種耐有機溶劑脂肪酶的產生菌、耐有機溶劑脂肪酶、耐有機溶劑脂肪酶基因以及該脂肪酶在有機相中催化手性醇拆分的應用。

為了實現本發明的目的，本發明首先從油污土壤等樣品中篩選獲得一株有機溶劑脂肪酶產生菌，分類命名為洋蔥伯克霍爾德氏菌Burkholderia?cepacia?RQ-3，保藏日期為2010年12月5日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏登記號為CCTCC?NO：M?2010330。

本發明對洋蔥伯克霍爾德氏菌Burkholderia?cepacia?RQ-3的生物學特征進行鑒定，該菌株為革蘭氏陰性菌株，菌落呈淺黃色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤；顯微鏡觀察菌體為桿菌，0.8～1.0×1.6～3.2mm，專性好氧，生長的最適溫度為30℃～35℃。其生理生化特性表現在：不出現反硝化反應、明膠反應結果為陽性，氧化酶陽性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麥芽糖。

經BIOLOG全自動細菌鑒定儀鑒定，Sim值為0.535（24h培養），結果顯示該菌屬于Burkholderia屬；16S?rDNA序列分析結果表明，該菌株與數據庫中多株Burkholderiacepacia菌的同源性為99%。綜合BIOLOG和16S?rDNA分析結果，該菌株鑒定為Burkholderia?cepacia，命名為Burkholderia?cepacia?RQ-3。

本發明對Burkholderia?cepacia?RQ-3進行了產酶條件優化，優化后產酶量高達71?U/mL，比優化前21.9?U/mL提高了2.2倍。

本發明對該菌產生的胞外酶進行了純化，經過一步Phenyl-Sepharose?FF層析，分離純化得到電泳純的耐有機溶劑脂肪酶，命名為脂肪酶RQ-3，純化后脂肪酶的比活性達到4142.3?U/mg。

本發明對脂肪酶RQ-3進行了酶學性質的研究，實驗證明該脂肪酶對多種有機溶劑都具有良好的耐受性，有機溶劑體系（十六烷、十四烷、異丙醇、乙醇等）中脂肪酶的穩定性提高，半衰期延長。脂肪酶RQ-3的最適反應pH為9.0，在pH?6.0～10.0的范圍具有很高的穩定性。其最佳反應溫度為40℃，此酶的最佳人工底物為對硝基苯酚豆蔻酯（C14）。