[發明專利]一種抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列

無效

• 申請號: 201110006968.1
• 申請日: 2011-01-13
• 公開（公告）號: CN102154291A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 沈會平;閻鶴;石磊
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明涉及siRNA雙鏈序列，具體為一種抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列。

背景技術

整合子是細菌基因組中的可移動遺傳物質，具有特異重組位點，可將許多耐藥基因盒(resistance?gene?cassette)整合在一起，從而形成多重耐藥。基因盒是一種可動遺傳因子(mobile?genetic?element)，目前發現了超過60種基因盒，它們均為抗菌耐藥基因盒。一個整合子可捕獲一個或多個耐藥基因盒。基因盒在整合酶的催化下，可以被整合到整合子的啟動子下游的attI位點上。整合酶在整合子中起重要作用，整合酶可以催化耐藥基因盒的整合和剔除，使得耐藥基因盒在不同的整合子中進行重新的組合。一個基因盒可以含有一個或者多個耐藥基因。同時，一個整合子內可以含有多個耐藥基因盒，所以一個整合子的結構可以介導多種耐藥性。由于整合子結構存在于多種細菌中，特別是致病菌和臨床菌株，整合酶使得不同耐藥基因在同種細菌和不同細菌中傳播從而逐漸增強了細菌的耐藥性并且利于細菌向耐藥的方向進化。在位于整合子5′保守區域的啟動子的作用下，整合子中的耐藥基因盒得以表達。在啟動子的作用下，耐藥基因基因盒的表達不僅依賴啟動子的強弱，而且與距離啟動子的遠近有關。當基因盒直接位于5′保守末端時，表達水平最強，而下游的基因盒表達水平較弱，且同一個基因盒在同一個整合子不同位點表達水平均不同。

在抗生素的選擇壓力下，由于整合子的整合作用，細菌能夠捕獲外來的耐藥基因，該系統在整合酶的催化下，將耐藥基因盒整合到自身上，并加以表達。同時由于整合酶的催化整合作用及基因盒的可動性，使得耐藥基因在畜禽與畜禽，畜禽與人類，人類與人類之間的病原菌上廣泛的傳播，這不僅為畜禽業的養殖帶來巨大的損失，同時給人類的健康帶來嚴重的威脅。一旦某些細菌對新抗生素產生抗性基因，這些抗性基因通過整合子的傳遞，就會形成對新抗生素的普遍抗性。這種方式獲得的耐藥性機率高，形成后也較穩定，是引起耐藥性散播的主要原因。因此，對整合酶及耐藥基因盒的表達調控因子進行研究，尋找沉默其基因表達的方法對控制和解決整合子引起的耐藥問題具有重大意義。

基因沉默主要發生在兩種情況：一種是轉錄水平上的基因沉(TGS)；另一種是轉錄后基因沉默(PTGS)。RNA干擾是指雙鏈RNA(dsRNA)在細胞內特異性地誘導與之同源互補的mRNA的降解，使相應基因的表達關閉，從而引發基因轉錄后水平沉默的現象。雖然在不同的有機體內有著細節性的差別，RNAi的作用機制是高度保守的，通常包含兩個階段：1)起始階段：內源性或外源性dsRNA被酶識別并切割成為片斷大小在21-23nt的小干擾RNA(siRNA)；2)效應階段：siRNA與核酸酶復合物結合，形成RISC(RNA誘導沉默復合體)，后者具有核酸內切酶活性，特異性的降解siRNA通過堿基互補原則識別的同源靶mRNA。整合子在細菌耐藥基因的水平轉移過程中起著相當重要的作用。RNAi是一種非常有用的基因敲除(gene?knockout)方法，具有高特異性、高速性、高穩定性、高效性等優點。因此，采用RNAi技術來沉默整合酶可以在一定程度上阻斷細菌耐藥基因的傳播，防止細菌耐藥性的繼續發展。同時，通過RNAi技術干擾整合子中耐藥基因的表達，從而減弱細菌的耐藥性，這在臨床治療和新型藥物的研究開發具有重要意義。RNAi的研究主要集中在真核生物基因功能調節及基因功能研究方面，此外，在醫學領域用于基因治療、抑制有害基因的表達、抗病毒治療(HIV等)、腫瘤癌癥的緩解和消除等方面。國內目前尚未見siRNA技術用于原核生物的報道。

發明內容

本發明就是為了解決如今日益嚴峻的整合子所導致的耐藥性問題，利用RNA干擾技術而設計了一種siRNA序列，將其導入耐藥菌菌株沉默和干擾整合子系統中整合酶基因對耐藥基因盒的捕獲及耐藥基因的表達。整合酶整合效率檢測方法對siRNA的干擾效率進行評估。最終達到通過siRNA控制和消除整合子引起的病原微生物耐藥問題。達到降低整合子整合耐藥基因盒的效率的目的。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種抑制耐藥基因盒整合的siRNA序列，該序列為下述序列中的任意一條或一條以上：

siRNA1：靶序列GCACATGCGTGTAAATCAT

正義鏈(5′-3′)5′-GCACAUGCGUGUAAAUCAU?dTdT-3′

反義鏈(3′-5′)3′-dTdT?CGUGUACGCACAUUUAGUA-5′

siRNA2：靶序列GCTGAAAGGTCTGGTCATA