[發明專利]產2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌

有效

• 申請號: 201110006851.3
• 申請日: 2011-01-13
• 公開（公告）號: CN102154191A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 廖志勇;楊小芳
• 申請（專利權）人: 北京賽諾百奧生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/40;C12R1/40
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種產2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌。

背景技術

來源于放線菌的次級代謝產物是臨床上藥物的重要來源，約70％的抗菌藥物屬于此類。由于這些次級代謝產物結構的復雜性，采用化學方法合成這些化合物成本高、操作繁瑣，不能滿足大量的商品化生產的需要。而采用原始菌進行次級代謝物的生產，往往菌體生長速度慢、產量低、難培養，遺傳背景不清晰，代謝產物不清晰，且很難進行遺傳操作，這些因素制約著對有價值的次級代謝產物的開發應用。近年來，次級代謝產物生物合成基因簇的異源表達成為提高化合物產量或有針對性地改造化合物的有效手段。

在異源表達宿主的選擇中，由于假單胞菌與放線菌密碼子的使用相近，有翻譯后修飾，安全無毒(如模式菌株惡臭假單胞菌Pseudomonas?putida?KT2440)，生長快速，次級代謝產物背景清晰等優點，成為首選的宿主菌之一。

P.putida?KT2440表達異源產物已有成功的例子，如粘細菌Stigmatella?aurantiaca?DW4/3-1的全基因組序列分析后發現至少有八個PKS型，NRPS型或PKS/NRPS雜合型的生物合成基因蔟，但常規的發酵和產物的分離純化只得到Myxothiazol一種化合物，對某“沉默基因蔟”敲除后所得變異株的分析發現，其HPLC圖譜比原株少一個特征峰。RulfMuller研究組將此“沉默基因蔟”克隆后，轉化至P.putidaKT2440中，在苯甲酸誘導下，得到了PKS/NRPS型化合物Myxochromide，發酵2天產量就達到了40mg/mL，而原株發酵7天的產量僅為8mg/mL。因此，可以通過基因工程方法大量地獲得新的、有潛在應用價值的化合物，為進一步的藥效學研究提供充足的原料來源。

但惡臭假單胞菌不能全面地提供復雜的次級代謝產物生物合成所需的小分子前體。如很多次級代謝產物需要以2S-甲基丙二酸輔酶A(2S-Methylmalonyl-CoA，2S-mmCoA)作為延伸單位，而在惡臭假單胞菌中不能檢測到2S-甲基丙二酸輔酶A的存在。雖然已有報道可進行化學合成2S-甲基丙二酰輔酶A，但化學合成成本大，技術難度高，而且很難得到單一的光學異構體產物，并且由于其不穩定性很難直接供給微生物作為合成底物利用，而2S-甲基丙二酰輔酶A在細胞內生成可直接用于次級代謝產物的合成，可大大降低發酵成本。因此在異源表達宿主菌中合成2S-甲基丙二酰輔酶A是最佳選擇，構建能夠產生2S-甲基丙二酸輔酶A的基因工程菌株，是異源表達需要以之作為前體物質的次級代謝產物的基礎，有著廣泛的應用價值。

已知生物體內有兩個2S-甲基丙二酸輔酶A的生物合成途徑。一是MCM途徑，即以三羧酸循環中的琥珀酰輔酶A為起始化合物，通過甲基丙二酰輔酶A變位酶(MCM)和甲基丙二酰輔酶A變位酶復合物保護蛋白(MeaB)的作用生成2R-甲基丙二酰輔酶A，再通過甲基丙二酰輔酶A異構酶(Epi)的作用而生成2S-甲基丙二酸輔酶A。另外一條是PCC途徑，即首先從L-丙氨酸、L-異亮氨酸或L-甲硫氨酸生成(或以奇數位脂肪酸降解)而獲得丙酰輔酶A，繼而在ATP的參與下通過羧化酶的作用生成2S-甲基丙二酸輔酶A，參與該過程的基因包括丙酰-CoA羧化酶基因和羧化酶復合物A亞單位基因。

為了異源表達需要以2S-甲基丙二酸輔酶A作為前體單元的myxothiazol，德國Rolf?Muller研究組將粘細菌Sorangium?cellulosumSoce56全基因組中成簇的mcm、epi和meaB三個基因通過同源重組整合至假單胞菌P.putida?KT2440的基因組中，所得菌株發酵后，經氣相色譜和質譜連用(GC/MS)檢測表明可產生4.68nmol/mL的2S-甲基丙二酸輔酶A。然而，該菌株2S-甲基丙二酸輔酶A的產量較低，直接影響了最終次級代謝產物的產量。

發明內容

本發明的目的是提供一種產2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌。

為了實現本發明目的，本發明的一種產2S-甲基丙二酰輔酶A的假單胞工程菌，其是將來源于天藍色鏈霉菌(Sterptomyces?coelicolor)的編碼丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和編碼羧化酶復合物A亞單位的accA1基因與篩選標記基因一起整合至惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)KT2440的基因組中而獲得。其中，所述篩選標記基因為卡那霉素抗性基因或慶大霉素抗性基因。