[發明專利]哺乳動物細胞大規模生產SDF-1-Fc的方法

無效

• 申請號: 201110006586.9
• 申請日: 2011-01-13
• 公開（公告）號: CN102154346A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 柴笑梅;朱月珍;楊宣武;周慧芳;江永海;吳咪佳
• 申請（專利權）人: 江蘇普羅賽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/85;C07K19/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種哺乳動物細胞大規模生產人基質細胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-1-Fc)的方法。

技術背景

基質細胞衍生因子-1(SDF-1)又稱為CXCL12，是一種小分子的細胞因子(約70氨基酸)，屬于趨化因子蛋白家族。其可以高效、高靈敏度地檢測SDF-1靶蛋白的特異性生物指標，用于腫瘤，炎癥和其他的惡性病變臨床診斷。

SDF-1在造血、發育、腫瘤的發生與遷移、介導炎癥和免疫反應等很多方面具有重要的生物學功能。SDF-1與其受體CXCR4在胚胎發育的過程對于胚胎的存活至關重要；在骨髓造血功能的形成，淋巴細胞生成及心室間隔的形成等過程也發揮著重要作用。SDF-1自身可以作為藥物用于與發育缺陷相關疾病的治療。

另外，SDF-1是一種高效的淋巴細胞、核細胞及樹突狀細胞的趨化因子，能介導T淋巴細胞緊密粘附并過內皮細胞，發生免疫反應。SDF-1還具有抗炎效應，可以逆轉抗原誘導的T細胞向炎癥部位的趨化運動。類風濕關節炎滑膜高水平表達SDF-1，在滑膜內表達CXCR4的記憶T細胞大量聚集。SDF-1能刺激滑膜遷移，并且抑制激活誘導的T細胞凋亡，作為一個重要的調節因子發揮抗炎作用。SDF-1蛋白產品作為免疫調節和抗炎類藥物是另一有廣闊前景的領域。默克、輝瑞等多家大型跨國藥物公司已展開以SDF-1蛋白作為藥物分子的技術和產品開發。

SDF-1在某些原位腫瘤如宮頸癌病人體內表達明顯升高，SDF-1可作為一種特異性的分子標記能夠用于早期的診斷；在對腫瘤遷移的很多研究中發現，某些腫瘤如前列腺癌或乳腺癌，SDF-1在某器官的高濃度表達代表了腫瘤細胞首先轉移的目的地。存在多部位浸潤的血液腫瘤患者，其血清中SDF-1的濃度明顯高于未出現浸潤患者。因此，將SDF-1作為腫瘤治療上的新靶點，阻斷SDF-1的產生或其與CXCR4的相互作用，可能有助于阻斷腫瘤細胞向周圍組織的擴散轉移。Millipore和R&D?system等研究機構和生物技術公司已在大力研發以SDF-1作為診斷指標用于早期疾病診斷的配套產品。

除此之外，SDF-1還與許多疾病，如HIV感染、心肌梗死、移植腎排異、急性缺血性腎損傷等密切相關。以SDF-1/CXCR4為靶分子的研究將可能為許多疾病的早期診斷和治療提供新的方向，在藥物研究及臨床檢驗中具有極大的市場潛力。

免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平將目的基因同IgG的Fc片段基因相連而表達的重組蛋白，同時具有目的蛋白及免疫球蛋白的結構域，從而賦予了重組蛋白獲得許多新的特性，拓展了蛋白在科研、制藥及臨床等方面的應用。

在重組蛋白表達的過程中，Fc重組蛋白易于結合ProteinA，從而簡化了蛋白的純化過程；Fc片段可以方便地進行流式、免疫組化和免疫共沉淀等方法檢測，可用于感興趣的基因研究；體外實驗中，Fc融合蛋白可用于拮抗或激活細胞表面受體用來研究受體-配體反應和信號通路；此外，Fc重組蛋白還能應用于噬菌體展示技術，如作為抗原制備人類全抗體庫。

另外，Fc片段還賦予了重組蛋白一些其它特性，增加了其在在制藥和臨床方面的應用價值。融合蛋白中加入重鏈的恒定區，其半衰期明顯延長，增加了其在體內的作用時間；Fc段能穿過胎盤、結合補體并介導補體依賴的細胞毒作用等；重組蛋白含有的鉸鏈區結構域使其形成二聚體或多聚體，增強了其抗原結合力。以上這些特點拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反應的治療方面的臨床應用前景。

目前全球僅有少數幾個公司采用大腸桿菌或其它表達系統生產SDF-1-Fc重組蛋白，質量參差不齊，總體水平不高。蛋白的表達體系和翻譯后修飾(糖基化程度)低限制了產品的純度和活性，難以滿足臨床診斷和治療的目的。用哺乳動物細胞生產SDF-1-Fc重組蛋白是生產科研和臨床用SDF-1的重要途徑，對于推動臨床診斷環節的新型生物技術發展和臨床藥物開發具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于實現用哺乳動物細胞大規模生產具有生物學活性的SDF-1-Fc蛋白的方法。在工業生產中滿足降低生產成本、簡化工藝流程、提高產品產量和質量的總體要求。

本發明提供一種哺乳動物細胞大規模生產人基質細胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-1-Fc)的方法，其特性在于該方法通過如下步驟實現哺乳動物細胞大規模生產人基質細胞衍生因子-1與人免疫球蛋IgG的Fc段融合基因(SDF-1-Fc)：

(1)制備轉染用質粒；

(2)制備PEI轉染溶劑；