[發明專利]一種密碼子優化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表達

有效

• 申請號: 201110005958.6
• 申請日: 2011-01-12
• 公開（公告）號: CN102586296A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 趙偉;姚泉洪;彭日荷;熊愛生;薛永;朱波;付曉燕;田永生;金曉芬
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/70;C12N9/42
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種密碼子優化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表達。

背景技術

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是纖維素酶的一個關鍵組分，它能夠催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中發現了β-葡萄糖苷酶。后來的研究發現，β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動物和微生物中，它參與生物體的糖代謝和胞內信號傳導等，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。β-葡萄糖苷酶在食品、飼料、醫療、生物能源等領域具有重要的應用價值。在食品工業中，β-葡萄糖苷酶能將水果、蔬菜、茶葉中的風味前體物質轉化為具有濃郁天然風味的香氣物質，用于食品增香；β-葡萄糖苷酶可以幫助多酚葡萄糖昔轉化為游離多酚，以提高多酚的生物活性或者幫助分離分析多酚；水解含有氰醇與葡萄糖形成的糖苷，消除不穩定氰醇的毒性等。在飼料工業中，β-葡萄糖苷酶可以用于對飼料中纖維素的降解，促進豬、雞等非反芻動物影響的吸收；在生物能源領域，β-葡萄糖苷酶是纖維素轉化生成乙醇的關鍵酶之一，通過水解纖維素分解過程中的纖維二糖，可以有效地減少纖維二糖纖維素酶的抑制作用。此外，β-葡萄糖苷酶在合成低聚龍膽糖等寡糖和相關的糖復合物中有廣泛的應用前景。

相對于真表達系統而言，大腸桿菌作為一種非常成熟的原核表達系統有諸多優點：1)對大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究已相當徹底，已有很多不同抗藥性、不同營養依賴型和不同校正突變型的菌種供選擇應用，可以根據不同的載體而選擇不同的菌種；2)盡管大腸桿菌細胞的空間小，但繁殖能力強，在營養條件充足時，20～30min即可繁殖一代，而且大規模發酵成本低，具有巨大的生產潛力；3)表達水平一般較真核系統高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達量可達總蛋白的5％～30％，且下游工藝簡單、易于控制。因此，大腸桿菌是生產β-葡萄糖苷酶較為理想的表達系統。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種密碼子優化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表達，所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因通過連續延伸PCR方法合成，并將本發明合成的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因轉化入大腸桿菌EG50中表達出高比活的β-葡萄糖苷酶。

為達到上述目的，本發明通過以下技術方案來實現：

所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因的核苷酸序列SEQ?ID?NO?1所示。

所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因的核苷酸序列編碼的蛋白質序列如SEQ?ID?NO?2所示。

本發明按照偏愛密碼子對野生型的Mbg1基因進行改造，改造后的基因序列與野生型序列(GenBank?Accession?No.CP000749)同源性為80％(參見圖1)，其編碼的蛋白質共447個氨基酸。

本發明的經密碼子優化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因合成采用連續延伸PCR方法。兩側引物分別加入BamHI和SacI酶切位點，使用的引物如下：

P1：GGA，TCC，ATG，TCT，ATC，ACT，CTT，CCA，TCT，CAC，TCC，AAG，ATG，CTG，ACC，TCC，GAC，TTC，ATC，TTT

P2：TGG，TAG，CAC，CTT，CAA，TCT，GGA，AAG，AGG，CAG，TAG，CAA，CAC，CAA，AGA，TGA，AGT，CGG，AGG，TCA

P3：CCA，GAT，TGA，AGG，TGC，TAC，CAC，TGC，TGA，CAA，CAG，ACT，CCC，ATC，CAT，CTG，GGA，TAC，CTT，CTG

P4：CTC，ACC，ATT，GTC，CAT，ACC，TTT，GAC，CTT，GCC，TGG，AGT，AGC，ACA，GAA，GGT，ATC，CCA，GAT，GGA

P5：AAG，GTA，TGG，ACA，ATG，GTG，AGA，TTG，CTT，GTG，ACC，ACT，ATC，ATC，TCT，GGG，AAC，AAG，ACA，TTC

P6：GAG，AGT，CTG，TAG，GCA，TCA，ACA，CCA，AGG，TCT，TTG，ATC，AGC，TGA，ATG，TCT，TGT，TCC，CAG，AGA

P7：GTT，GAT，GCC，TAC，AGA，CTC，TCC，ATT，GCT，TGG，CCA，AGA，GTC，ATG，GAC，AAG，AAA，GGT，GAA，GCT