[發(fā)明專利]一種紫菜活性肽的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110005665.8
• 申請日: 2011-01-12
• 公開（公告）號: CN102154423A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 姚興存;舒留泉;盤賽昆
• 申請（專利權(quán)）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種活性肽的制備方法，特別是一種紫菜活性肽的制備方法。

背景技術(shù)

公開號為CN1687444、申請?zhí)枮镃N200510038532.5的中國公開專利文獻公開了一種“利用酶-膜耦合技術(shù)制備紫菜降血壓肽的方法及其用途”，該技術(shù)為酶-膜耦合技術(shù)制備紫菜降血壓肽的方法，選用的蛋白酶為胰蛋白酶、復合蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶以及由其構(gòu)成的復合酶。該發(fā)明的核心技術(shù)為酶-膜耦合技術(shù)，產(chǎn)品產(chǎn)量得到提高，但是也存在著操作復雜，在實際生產(chǎn)中難以實現(xiàn)的缺陷，與本發(fā)明使用的木瓜蛋白酶不同。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種方法更為合理、可操作性強的紫菜活性肽的制備方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種紫菜活性肽的制備方法，其特點是，其步驟如下：

（1）以條斑紫菜（Porphyra?yezoensis）為原料，烘干后粉碎，過篩，取150-200目部分，按照原料與水重量體積比1:100?g/mL向原料中加水并混合均勻；然后將料液放入超聲波細胞粉碎機破碎處理，超聲波功率650W，空化比為30%，料液溫度保持在50℃，破碎處理時間為15min；將超聲波處理后的物料在離心機上4000r/min離心10min，得上清液；

（2）取上清液用1mol/L?NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，按照原料條斑紫菜重量的1%加入酶活力為3×10⁵U/g的木瓜蛋白酶，充分混合均勻后置于55℃的水浴中水解，每間隔20min攪拌振蕩一次，反應過程中監(jiān)測pH的變化，適時加入NaOH或HCl調(diào)整pH，保持pH為7.0，持續(xù)水解5小時；酶解結(jié)束后，加熱升溫到100℃并保持10min，破壞木瓜蛋白酶的活性，冷卻，在8000r/min的離心機中離心15min，所得上清液即酶解液；

（3）將酶解液通過1×10⁵Da分子量的超濾膜，去除殘留的生物大分子物質(zhì)和雜質(zhì)，濾液經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥，即得紫菜活性肽凍干品。

本發(fā)明活性肽生物活性的定量如下。將本發(fā)明方法制得的活性肽凍干品分別用于測定抗氧化活性和降血壓活性，羥自由基清除率采用活性肽對Fenton體系產(chǎn)生羥自由基的清除實驗法，二苯代苦味酰基自由基清除率采用體外實驗測定法，體外降血壓活性的測定采用紫外比色法用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的抑制率來表示，相對分子質(zhì)量分布采用凝膠層析法測定。測定結(jié)果表明，其清除羥自由基時的IC₅₀值（清除率為50%的活性肽濃度）為0.397mg/mL，清除二苯代苦味酰基自由基時的IC₅₀值為0.423?mg/mL，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的半抑制濃度IC₅₀值為4.48mg/mL，活性肽的相對分子量主要分布于1000-2000Da之間，屬小分子肽類。

本發(fā)明是木瓜蛋白酶法制備活性肽的技術(shù)，其技術(shù)特征為制備工藝和工藝參數(shù)的掌握。主要表現(xiàn)在技術(shù)路線簡單，使用的超聲處理、離心分離、酶水解、濃縮、凍干等方法，在實驗室以及實際工業(yè)生產(chǎn)中容易實現(xiàn)；本發(fā)明工藝參數(shù)為實現(xiàn)上述處理方法時的最佳工藝條件，經(jīng)過了實驗室的大量實驗而得到的，得到了多次驗證實驗的證實，數(shù)據(jù)真實、可靠。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

（1）它解決了活性肽制備過程中紫菜粉碎顆粒細度的問題，經(jīng)過試驗研究證實應該以150-200目的顆粒細度最佳。紫菜顆粒過大，紫菜細胞中的水溶性蛋白質(zhì)不易提取，得率顯著下降且提取時間顯著延長；顆粒太小，后續(xù)的離心分離困難，得到蛋白質(zhì)溶液中雜質(zhì)含量較高。

（2）本發(fā)明所述的超聲波處理有效地破壞紫菜的細胞壁，使細胞內(nèi)的水溶性蛋白質(zhì)充分溶出，按照本方案超聲波處理的條件來處理料液，顯著提高了蛋白質(zhì)的提取率。經(jīng)實驗測算，本發(fā)明超聲處理方法及工藝參數(shù)使蛋白質(zhì)的提取率高達39.5%，比常規(guī)的提取率25%提高了近15個百分點。

（3）在作用于不同的底物（本發(fā)明的底物即為紫菜）時，木瓜蛋白酶的水解條件是不同的，本發(fā)明進一步優(yōu)化了紫菜作為水解底物時的水解條件，可以得到最大的水解效果，同時其生物活性也得到最大程度的保留。

（4）經(jīng)過分析測定，本發(fā)明制備的紫菜活性肽在清除羥自由基和二苯代苦味酰基自由基方面效果良好，清除羥自由基的能力高于陽性對照的VC，清除二苯代苦味酰基自由基的能力與陽性對照的BHT（二丁基羥基甲苯）相當；同時，也具有良好的降血壓活性。

具體實施方式