[發(fā)明專利]蛋白酶體β亞單位6作為蚊對溴氰菊酯抗性檢測的靶標的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110004939.1
• 申請日: 2011-01-12
• 公開（公告）號: CN102154467A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈波;孫海波;張東輝;賀驥;孫林春;于婧;張利;馬磊;孫艷;朱昌亮
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白酶體β亞單位6（PSMB6）作為蚊對溴氰菊酯抗性檢測的靶標的應(yīng)用。

背景技術(shù)

蚊可以傳播多種疾病，危害人類健康。化學防治一直是蚊媒防制規(guī)劃中的主要方法。然而連續(xù)，大量地使用殺蟲劑導致蚊媒抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，抗藥性已成為控制蚊媒傳播疾病的最大障礙。蚊媒抗藥性治理的前提在于早期發(fā)現(xiàn)抗藥性和監(jiān)測抗藥性的發(fā)展。所以，抗藥性檢測一直是蚊媒防制研究的重點課題。尋找有效的抗藥性檢測靶標對于抗藥性治理具有非常重要的意義。

本發(fā)明中的蛋白酶體是生物體內(nèi)的一種巨型蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要作用是降解細胞不需要的或受到損傷的蛋白質(zhì)。PSMB6是蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的一個催化亞基。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供PSMB6的一種新用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：PSMB6作為蚊對溴氰菊酯抗性檢測的靶標的應(yīng)用。

發(fā)明人利用二維電泳和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的方法，發(fā)現(xiàn)PSMB6蛋白質(zhì)在蚊對溴氰菊酯敏感細胞和抗性細胞中的表達有差異，在抗性細胞中高表達，為敏感細胞的1.60倍（p<0.05）。進一步的定量PCR試驗驗證了這一結(jié)果。PSMB6基因在蚊對溴氰菊酯抗性細胞中高表達（p<0.05）。結(jié)果表明，PSMB6可能與蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)。

發(fā)明者為了進一步研究PSMB6在蚊對溴氰菊酯抗性中所起的作用，設(shè)計并合成了針對PSMB6基因的siRNA。用siRNA干涉PSMB6基因的表達后，檢測在溴氰菊酯作用下抗性細胞的存活率。結(jié)果顯示，干涉PSMB6后，抗性細胞的存活率較對照組顯著下降（p<0.05），表明PSMB6可以影響蚊對溴氰菊酯的抗性。

PSMB6基因在蚊抗性細胞中較敏感細胞高表達；其編碼的PSMB6在蚊抗性細胞中也較敏感細胞高表達；干涉PSMB6后，抗性細胞對溴氰菊酯的敏感性增加。結(jié)果表明，PSMB6與溴氰菊酯抗性相關(guān)。

本發(fā)明公開了通過檢測蚊細胞中蛋白酶體β亞單位6的表達量來判斷蚊對溴氰菊酯的抗性。具體是；以定量PCR檢測待測品系和敏感品系的蛋白酶體β亞單位6基因表達，當待測品系的蛋白酶體β亞單位6基因的表達量大于或等于敏感品系的1.60倍時，待測品系對溴氰菊酯具有抗性。

發(fā)明者選取國內(nèi)通用的實驗室淡色庫蚊敏感品系（LC50為0.02ppm）作為參照，以定量PCR檢測PSMB6基因的表達。PSMB6基因的表達是敏感品系的1.60倍，?即可認定其對溴氰菊酯具有抗性。

取經(jīng)世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的標準方法鑒定的山東淡色庫蚊敏感品系（LC50為0.02ppm）和抗性品系（LC50為0.55ppm），定量PCR檢測PSMB6基因的表達。結(jié)果表明，其抗性品系PSMB6基因的表達是敏感品系的1.60倍（p<0.05）。?因此，PSMB6基因作為蚊對溴氰菊酯抗性檢測的靶標可以理解。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個蚊對溴氰菊酯抗性檢測的靶標，對于蚊溴氰菊酯抗藥性的早期發(fā)現(xiàn)和治理具有重要價值。

附圖說明

圖1是PSMB6在敏感和抗性蚊細胞中表達差異的二維電泳圖。

圖2是利用二維電泳圖中PSMB6蛋白質(zhì)點的灰度值作圖，直觀地反應(yīng)PSMB6在敏感抗性細胞中的表達差異。

圖3是定量PCR的方法驗證PSMB6在敏感和抗性細胞中mRNA水平的表達。

圖4是siRNA干涉PSMB6的表達后，CCK-8法檢測抗性細胞存活率。

圖5是定量PCR的方法驗證PSMB6在山東敏感和抗性蚊中mRNA水平的表達。

具體實施方式

除非特別說明，本發(fā)明中所使用的術(shù)語，一般為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內(nèi)容相同。

實施例1?PSMB6蛋白質(zhì)在蚊溴氰菊酯抗性細胞中較敏感細胞高表達。

蚊敏感細胞購自中國軍事科學院，在本實驗室經(jīng)溴氰菊酯逐代篩選，培養(yǎng)出抗性品系。抗性品系的LC50為1256.8mg/ml,是敏感品系的8.9倍（141.2mg/ml）。