[發明專利]一種對阪崎腸桿菌O抗原特異的核苷酸及其應用

有效

• 申請號: 201110004830.8
• 申請日: 2011-01-11
• 公開（公告）號: CN102154270A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 王磊;何欣;王敏;孫亞民;曹勃陽
• 申請（專利權）人: 天津生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明涉及一種對阪崎腸桿菌O抗原基因簇特異的核苷酸及其應用，尤其涉及一種對阪崎腸桿菌O抗原基因簇中單個基因特異的核苷酸及其應用。

背景技術

阪崎腸桿菌是人和動物的腸道寄生菌和條件致病菌，已被世界衛生組織和許多國家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，可導致任何年齡層人群的疾病，尤其是對早產兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，嚴重者可導致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結腸炎，死亡率可達40％～80％。目前，微生物學家尚不清楚阪崎腸桿菌的污染來源，但多份研究報告表明嬰兒配方奶粉是當前發現致嬰兒、早產兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結腸炎的主要感染渠道，阪崎腸桿菌已引起世界多國相關部門的重視，已被列為嬰兒配方奶粉的A類致病菌。

目前阪崎腸桿菌的分類地位剛剛建立，其O抗原血清型的研究也逐漸成為熱點。脂多糖是革蘭式陰性細菌的主要表面成分，包括類脂A，核心多糖和O抗原。O抗原是革蘭氏陰性細菌脂多糖分子的最外層結構，它是由多個寡糖重復單位組成的多糖鏈，重復單位一般由3～6個單糖組成。在大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌中，負責O抗原合成的基因相鄰排列于兩個持家基因galF和gnd之間，在染色體上形成一個基因簇。O抗原基因簇內部的基因通常分為三類：單糖合成酶基因、糖基轉移酶基因和寡糖單位處理酶基因。單糖合成酶負責單糖前體的合成，糖基轉移酶負責將單糖串聯成寡糖重復單位，而寡塘單位處理酶負責將寡糖單位從內膜內側轉運到內膜外側，并將寡糖單位進行串聯。

脂多糖特別是其中的O-抗原的組成和結構的變化決定了革蘭氏陰性細菌細胞表面抗原決定簇的多樣性，比如國際上根據脂多糖的結構特性而鑒定過沙門氏菌屬的抗原類型多達2107個。血清分型是一種經典和常用的流行病學調查手段，對于臨床研究及疫苗研制具有重要意義。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數量不足，大量的抗血清在制備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，不同的O抗原產生的抗血清之間經常存在交叉反應。因此，建立基于分子生物學技術的血清鑒定方法成為目前的發展方向。現在普遍認為這種傳統的血清學檢測方法將為現代分子生物學方法取代。

近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉錄間隔區(ITS)序列分析、隨機擴增長度多態性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態性(RFLP)分析等。分子生物學方法不僅可用于阪崎腸桿菌的快速血清分型篩查，穩定的鑒定結果可以彌補表型特征鑒定方法的不足。和傳統檢測技術相比，這些基于多聚酶鏈式反應(PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強等優點。

不同抗原的糖基轉移酶和寡糖單位處理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型特異性，可用作靶基因進行分子生物學鑒定。寡糖單位處理酶基因包括O抗原轉運酶基因(wzx)和O抗原聚合酶基因(wzy)。利用上述兩個基因作為血清型分型檢測的特異靶基因是十分理想的。如大腸桿菌(王威，彭霞，2006年)、變形桿菌和沙門氏菌均有利用該基因做特異檢測的實例。

聚合酶鏈式反應技術(Polymerase?chain?reaction，簡稱PCR技術)作為微生物檢測技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需1個半小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

不論從國內和國際的角度來看，快速、準確地鑒定出血清類型，為阪崎腸桿菌的防控提供有效技術支持是十分重要的。

發明內容

本發明的目的在于提供一種對阪崎腸桿菌抗原特異的核苷酸，所述核苷酸包括：

1)SEQ?ID?NO：1-15所示核苷酸中的至少一種；

2)與SEQ?ID?NO：1-15所示核苷酸互補的核苷酸中的至少一種。

本發明進一步公開了核苷酸序列在制備檢測阪崎腸桿菌用PCR試劑盒或基因芯片方面的應用。

本發明還公開了一種快速檢測臨床標本的PCR試劑盒，該試劑盒包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ?ID?NO：1-15所示的核苷酸中的至少一種。