[發明專利]香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法與應用無效

申請號：	201110003516.8	申請日：	2011-01-10
公開（公告）號：	CN102154462A	公開（公告）日：	2011-08-17
發明（設計）人：	林壁潤;李培謙;沈會芳;蒲小明;潘群英	申請（專利權）人：	廣東省農業科學院植物保護研究所
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/04
代理公司：	廣州市華學知識產權代理有限公司 44245	代理人：	裘暉
地址：	510640 廣***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測方法應用
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于農作物病害防治及植物檢疫領域，具體涉及一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法與應用，即利用聚合酶鏈式反應(PCR)分子生物學技術對香蕉細菌性軟腐病害病原菌進行高靈敏度快速檢測，可用于香蕉種苗檢疫、田間香蕉軟腐病的早期診斷以及病菌的監測和鑒定。

背景技術

香蕉細菌性軟腐病病原菌為菊基腐病菌(Pectobacterium?chrysanthemi)，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)歐文氏菌屬(Erwinia)。該病原菌的致病性很強，可能為強致病亞種。這是我國新入侵危險病害，于2009年9月在廣州番禺香蕉種植區首次發現，主要危害粉蕉、巴西蕉等。該病害為系統性維管束病害，首先內部葉片近葉柄處變臟黃色，葉柄崩潰，葉片萎蔫而死亡。感病假莖橫切面維管束變綠黃色至紅褐色，甚至黑色，尤其是里面葉鞘和果柄、假莖、根圍及單個香蕉上均有暗色膠狀物質及細菌菌溢。染病植株6～8天死亡，發病率達20～40％，嚴重地塊可達90％以上，發病植株死亡率100％，且以較快的速度擴大感染面積。該病具有傳播快，毀滅性強等特點，給香蕉生產造成巨大的經濟損失。

香蕉細菌性軟腐病初期發病癥狀和香蕉枯萎病有些相似，故蕉農很難準確判斷病原，傳統的病原菌分離培養鑒定的方法又依賴于專業人員豐富的經驗和系統的病原菌分類的理論知識，這樣就會貽誤最佳的防治時機。目前，防治香蕉細菌性軟腐病還沒有行之有效的方法。主要是以并定期檢查蕉園，發現零星病株及時清除銷毀，并撒施生石灰處理病土區，種植抗病耐病香蕉品種等綜合防治措施。香蕉細菌性軟腐病在溫濕度適宜的條件下發病迅猛，健康植株一旦染病會很快死亡。因此，對香蕉細菌性軟腐病應以預防為主，著重加強對該病害的檢疫檢測。為防止香蕉細菌性軟腐病從疫區傳入非疫區，確保國內香蕉的安全生產，建立一套穩定、簡便、快速、靈敏的分子檢測方法對香蕉種苗及種植區的土壤進行檢疫檢測是非常必要的。PCR檢測方法具有靈敏度高、精度高、取樣量微小、檢測時間短等優點。通過該技術對香蕉種苗、種植區土壤浸提液、灌溉水等定性檢測，為確保我國香蕉無病種苗生產基地的建設、安全生產，同時堵截國外危險性帶病香蕉傳入我國具有重要意義。

發明內容

本發明的主要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法。該方法操作簡便易行，可以以試劑盒的形式直接應用于生產實踐，用于帶菌植物組織和土壤的高靈敏度快速檢測，確保為生產提供健康無菌種苗、對病原菌分子預警具有十分重要的意義。

本發明的另一目的在于提供所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，包括以下步驟：

(1)設計PCR引物，其中：

上游引物LF：5’-TTCGTCTAGAGGCCCAGGAC-3’

下游引物LR：5’-TCAGCTTGTTCCGGATTGTT-3’

(2)對樣本進行處理，得到樣本中的DNA；然后以樣本的DNA為模板，進行PCR反應，電泳檢測PCR產物，當PCR產物呈現171bp條帶，即樣本中含有香蕉細菌性軟腐病害病原菌。

步驟(2)中所述的樣本為香蕉植株組織時，所述處理的方式優選為利用CTAB法抽提香蕉植株組織中的DNA；

步驟(2)中所述的樣本為土壤時，所述處理的方式優選為用無菌水浸泡土壤，得到的上清液為模板；更優選為每0.5克土壤使用1ml無菌水浸泡半小時，得到的上清液為模板；

步驟(2)中所述的樣本為病水時，所述處理的方式優選為用0.22μm的濾膜對病水進行過濾富集，制備更高濃度的病水直接作為模板；

步驟(2)中所述PCR反應中的反應條件優選為94℃預變性5min；94℃變性20s，53℃退火20s，72℃延伸30s，35個循環；72℃總延伸10min；