[發(fā)明專利]一種制備脫氧核糖核苷三磷酸的新方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110003406.1
• 申請日: 2011-01-10
• 公開（公告）號: CN102168123A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 呂朝陽;張煜星
• 申請（專利權(quán)）人: 呂朝陽
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12P19/30;C07H19/04;C07H1/04
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種利用化學(xué)合成-酶促合成兩步法的全新工藝，用料價格低廉，生產(chǎn)成本較低，無環(huán)境污染，可大規(guī)模制備脫氧核糖核苷三磷酸。

背景技術(shù)：

DNA合成的基礎(chǔ)物質(zhì)是脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同，dNTP可分為dATP、dCTP、dTTP、dGTP。人工合成的DNA片段已廣泛應(yīng)用于基因工程和分子生物學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域。雖然dNTP的制備研究曾有不少報道，如Yoskihawa等用POCl₃將脫氧核苷磷?；玫揭悦撗鹾塑斩攘姿釣橹鞯漠a(chǎn)物；Ludwig發(fā)現(xiàn)脫氧核苷二氯磷酸可以在中性無水DMF溶液中與過量的焦正磷酸三丁胺反應(yīng)生成核苷三磷酸等等。但所有這些方法均有一定的缺陷，大部分的生產(chǎn)方法的合成量在1mmol以下，化學(xué)法合成法的后處理相當(dāng)困難，且收率極低，產(chǎn)品中存在的焦磷酸鹽將影響DNA聚合酶的催化活性，從而影響DNA的合成。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所述脫氧核糖核苷三磷酸的制備方法包括以下步驟：

正磷酸三丁胺的制備：三正丁胺100-150ml，85％磷酸40-60ml，以1000ml乙醇為溶劑，室溫下攪拌反應(yīng)半小時，之后在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至糖漿狀。然后分別用500ml無水乙醇溶解，減壓蒸干三次，殘留物為微黃色透明糖漿狀正磷酸三丁胺。

dNDP的化學(xué)合成：dNMP水溶液用鹽酸調(diào)pH值為4-6，加入5-10倍物質(zhì)量的DCC、4-8倍物質(zhì)量的正磷酸三丁胺，以等體積的乙醇作為溶劑，80℃攪拌反應(yīng)10小時，冰浴100min后過濾除去不溶物，所得液體在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到的混合物加入50-60倍體積的水溶解，用氫氧化鈉調(diào)溶液的pH為6-8，所得混合物為dNMP、dNDP和磷酸鹽的水溶液，其中含dNDP70％-90％，經(jīng)陰離子樹脂柱層析分離，以醋酸、醋酸鈉的緩沖液為洗脫劑，0.1-0.5mol/L的濃度梯度洗脫，得到純度為97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液體積的無水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)可得到白色的dNDP固體粉末。

dNTP的酶促反應(yīng)：dNDP水溶液中加入4-6倍物質(zhì)量的PEP-Na，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6-8，以ATP-Na為催化劑，根據(jù)酶的活性加入丙酮酸激酶和金屬離子，如氯化鋰、硫酸鋰、醋酸鋰、七水硫酸鎂、氯化鉀、硫酸鉀等；在50-60℃條件下進行酶促反應(yīng)48-72小時，即可得到dNDP和dNTP的混合物，dNTP的含量在60％-80％之間，將該混合物用陰離子樹脂柱層析分離，以醋酸、醋酸鈉的緩沖液為洗脫劑，0.1-0.5mol/L的濃度梯度洗脫，得到純度為97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液體積的無水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)可得到白色的dNTP固體粉末。

本發(fā)明以dNMP為原料，采用化學(xué)合成-酶促合成相結(jié)合的方法合成dNTP。在dNMP合成dNDP的過程中，dNDP的收率為70％-90％，dNDP再經(jīng)酶促反應(yīng)生成dNTP的過程中，dNTP的收率在60％-80％之間，且未反應(yīng)的dNDP可回收用于下次繼續(xù)反應(yīng)，原料沒有損耗，適合工業(yè)循環(huán)生產(chǎn)，且無廢氣、廢物環(huán)境污染。

具體實施方式：

實施例1正磷酸三丁胺的制備

取三正丁胺200ml、85％磷酸90ml，以2000ml乙醇為溶劑，室溫下攪拌反應(yīng)半小時，之后在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至糖漿狀。然后分別用1000ml無水乙醇溶解，減壓蒸干三次，得殘留物為微黃色透明糖漿狀正磷酸三丁胺250克左右。

實施例2?dNDP的化學(xué)合成

稱取dNMP固體100克，溶于500ml去離子水中，用鹽酸調(diào)溶液pH值為5，加入300克的DCC、250克正磷酸三丁胺，以1000ml的乙醇作為溶劑，80℃攪拌反應(yīng)10小時，反應(yīng)之后冰浴100min，過濾除去不溶物，所得液體在40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到的混合物加入800ml的水溶解，用氫氧化鈉調(diào)溶液的pH為中性，所得混合物為dNMP、dNDP和磷酸鹽的水溶液，用陰離子樹脂柱層析分離，以醋酸、醋酸鈉的緩沖液為洗脫劑，0.1-0.5mol/L的濃度梯度洗脫，得到純度為97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液體積的無水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)可得到白色的dNDP固體粉末100克，以dNMP為原料計算，本步收率為83.1％。

實施例3?dNTP的酶促合成

稱取dNDP固體100克，溶于500ml去離子水中，加入200克的PEP-Na，溶液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH為中性，加入0.5克ATP-Na、1.5萬單位的丙酮酸激酶和50毫克的金屬離子，如氯化鋰、硫酸鋰、醋酸鋰、七水硫酸鎂、氯化鉀、硫酸鉀等；在50-60℃條件下進行酶促反應(yīng)48-72小時，即可得到dNDP和dNTP的混合物，將該混合物用陰離子樹脂柱層析分離，以醋酸、醋酸鈉的緩沖液為洗脫劑，0.1-0.5mol/L的濃度梯度洗脫，得到純度為97％-99％的dNDP水溶液，再加入2倍溶液體積的無水乙醇使其沉淀，沉淀在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)可得到白色的dNTP固體粉末80克。本步的收率為72.5％，如以dNMP為起始原料計算，總收率為60.4％。