[發明專利]雞CRBP1基因遺傳變異的檢測方法和應用

無效

• 申請號: 201110003324.7
• 申請日: 2011-01-10
• 公開（公告）號: CN102134606A
• 公開（公告）日: 2011-07-27
• 發明（設計）人: 肖禮華;朱慶;趙小玲;劉益平
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因變異的檢測方法，具體涉及雞CRBP1基因遺傳變異的檢測方法和應用。

背景技術

單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)，主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性，包括單堿基的轉換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。第1代分子標記限制性片段長度多態性(RFLP)主要研究對象是由限制性酶切位點的差異造成的DNA片段長度多態性；第2代分子標記是數目可變的串聯重復序列(VNTR)，包括小衛星(minisatellite)和微衛星(microsatellite)。與前二代分子標記相比，SNPs具有以下特點：(1)數量多、覆蓋密度大，據估計平均每1000bp就會出現一個。目前已檢測出93％的人類基因包含SNPs，98％的SNPs其距離不超過5kb，因此，可以在幾乎每個基因的內部或附近提供一系列標記；(2)由于SNPs一般只有2個等位基因，在檢測時只需要通過一個簡單的“+/-”方式即可進行基因分型，這使得檢測、分析易于實現自動化；(3)遺傳穩定性強，與微衛星等重復序列多態性標記相比，SNPs具有更高的遺傳穩定性；(4)多態性豐富，SNPs包含了目前已知DNA多態性的80％以上，是最常見的遺傳變異類型。基于單核苷酸多態性的上述優點，研究SNP有助于解釋不同個體表形性狀的差異，不同群體和個體對疾病、環境因子等反應的差異。

目前對SNP進行檢測的方法較多，而大多數實驗室采用的是成本相對較低、技術易掌握、檢出率較高、快捷、安全和步驟簡單的PCR-SSCP技術。該方法原理是：經PCR擴增的目的片段在變性劑或低離子濃度下經高溫處理使之解鏈并確保成為DNA單鏈，然后在一定濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結構的構象，這種構象由DNA單鏈堿基決定，其穩定性靠分子內局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構象不同，電泳遷移率也不同，PCR產物變性后，單鏈產物經中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因靶DNA中發生單堿基置換，或個別堿基插入或缺失時，因遷移產生變化會出現泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區分開。相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構象就會不同，其在凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態型。

SNP有非同義cSNP、同義cSNP、內含子區SNP、調控區的rSNP幾類，均能從不同角度影響基因功能，其中非同義cSNP由于改變基因編碼的氨基酸，從而影響基因功能；同義cSNP可通過改變mRNA的二級結構、翻譯速度等影響基因功能的發揮；內含子區SNP可通過改變剪接位點的活性來影響基因功能；調控區的rSNP則可通過影響啟動子元件來調節基因的功能。

CRBP1是一類與維生素A(VA)代謝有關的疏水性小分子，擔任著轉運視黃醇(VA)的任務，從而參與體內許多生物學過程，如視覺、繁殖、上皮細胞的維持、骨的生長發育等。Su等(2004)以79個人組織和61鼠組織為研究材料，采用微陣列技術制作了CRBP1基因的表達模式圖，其結果顯示，該基因在機體表達水平表現出組織差異性，在下丘腦、子宮、卵巢、睪丸幾個繁殖軸組織中均有表達，以卵巢表達量最高。RICHARD等(1996)分別采用免疫組織化學、甲硫氨酸標記親和層析兩種方法僅從小鼠子宮的間質細胞中分離CRBP1。因此研究CRBP1基因遺傳變異和分子遺傳特征對動物生長發育、繁殖具有重要理論意義和實踐意義。

迄今為止，國內外均未見雞CRBP1基因遺傳變異的研究，由于中國地方雞種CRBP1基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與產蛋性狀(如產蛋量、開產體重、開產蛋重等)關聯的研究仍是空白。

發明內容

本發明的目的在于，采用PCR-SSCP技術檢測雞CRBP1基因的單核苷酸多態性，并將其與生產性狀進行關聯分析，以篩選出SNP位點以輔之于育種，加快畜禽育種進程。

為了實現上述目的，本發明采取如下技術方案：

一種雞CRBP1基因遺傳變異的檢測方法，其特征在于包括提取雞血樣基因組DNA；對基因組DNA進行PCR擴增，在PCR擴增時使用的上游引物序列為：TAAATTTATAGTTGCGGTCAT，下游引物序列為：AGTTCCAGGTGACGGGTGAG；將擴增產物進行凝膠電泳并拍照，分析電泳結果。