[發(fā)明專利]基于表面等離激元共振的HPRT體基因突變檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110002965.0
• 申請日: 2011-01-10
• 公開（公告）號: CN102162792A
• 公開（公告）日: 2011-08-24
• 發(fā)明（設計）人: 張曉紅;張海黔
• 申請（專利權）人: 南京航空航天大學
• 主分類號: G01N21/63
• 分類號: G01N21/63;G01N33/573;G01N1/28;C12Q1/48
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域

本發(fā)明屬于一種酶的定量檢測方法，具體基于表面等離激元共振的HPRT體基因突變檢測方法。

背景技術

流行病學調(diào)查和實驗研究表明環(huán)境物理化學因素是腫瘤發(fā)病的主要原因，誘變劑和致癌劑的符合率為80%。因此，建立適當方法檢測物理化學因素性的誘變對減少致癌風險具有重要意義。哺乳動物細胞次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine-Guanine?Phosphoribosyl?Transferase，HPRT)是一種細胞漿酶。國內(nèi)外研究表明其基因位點對化學誘變劑和電離輻射較敏感。根據(jù)這一特點建立的體外哺乳動物細胞HPRT基因突變檢測方法被用來評估各種突變因素（輻射、各種化學因子等）對生物體所造成的損傷。該方法的原理如下：在正常情況下，由于6-硫代鳥嘌呤(6-TG)的結構與次黃嘌呤和鳥嘌呤相似，HPRT可催化6-TG與5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphate，PRPP)生成6-硫代鳥嘌呤單核苷酸(6-TGMP)。6-TGMP可摻入DNA的合成，阻斷半保留復制，造成細胞的死亡。而當細胞HPRT基因突變后，不能編碼生成野生型HPRT酶，就不能催化6-TG形成6-TGMP影響DNA的復制。因此，在含6-TG的選擇性培養(yǎng)基中，HPRT基因突變的細胞存活，非突變型細胞則死亡。HPRT基因突變檢測方法就是利用計數(shù)6-TG選擇性培養(yǎng)基中存活的細胞數(shù)來估計HPRT基因是否發(fā)生突變及突變發(fā)生的程度，從而確定生物體是否損傷及損傷的程度。

檢測體外哺乳動物細胞HPRT基因突變的方法有多核細胞法、放射自顯影法、5-溴脫氧尿嘧啶法和克隆法，它們的基本原理如前所述都是一致的。均是以細胞是否存活（即HPRT酶的功能是否正常）來反映HPRT基因是否突變，只是表征細胞存活的方法不同。

多核細胞法：將細胞松弛素-B加入含6-TG的選擇性培養(yǎng)基中，計數(shù)該選擇性培養(yǎng)基中存活的雙核細胞。具體步驟為：將哺乳動物淋巴細胞接種于生長培養(yǎng)液中(內(nèi)含90%PR-MI1640,10%滅活小牛血清、慶大霉素100IU/ml)。其中一個樣品加入6-TG，使其終濃度為1×10^-5mol/l。37.0±0.3℃條件下培養(yǎng)33h后，加入細胞松弛素-B（終濃度為6?ug?/ml），再繼續(xù)培養(yǎng)至72h。培養(yǎng)物離心、低滲、固定、制片。每個樣本計數(shù)6000個轉化淋巴細胞(其中加與不加6-TG各計數(shù)3000個)。統(tǒng)計其中在同一胞漿內(nèi)具有完整核膜的雙核或多核淋巴細胞數(shù)(包括相壓、相切和分離的雙核或多核細胞)。將含6-TG的1000個轉化淋巴細胞中雙核或多核淋巴細胞數(shù)除以不含6-TG的1000個轉化淋巴細胞中雙核或多核淋巴細胞數(shù)，所得結果為HPRT基因位點突變率(‰)。

放射自顯影法、5-溴脫氧尿嘧啶法與多核細胞法方法類似，只是放射自顯影法是計數(shù)6-TG選擇性培養(yǎng)基中存活的具有³H標記的細胞（實驗須接觸放射性物質(zhì)），而5-溴脫氧尿嘧啶法是計數(shù)5-Brdu標記的存活細胞（需Gemsia染色）。

克隆法：將哺乳動物淋巴細胞分為正常細胞克隆和突變細胞篩選兩個實驗部分。正常細胞克隆板的每孔加200?ul含1000?U/ml人重組白細胞介素-2(IL-2)，來自自體的20%淋巴細胞刺激液和1×10⁶個滋養(yǎng)細胞，?20%小牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液，每孔種2個靶細胞，每個樣本共種10個細胞。同時為使每孔種的細胞數(shù)相當，克隆孔的每孔中再加2×10⁴個經(jīng)100?Gy?⁶⁰Coγ射線照射后的靶細胞；在篩選板中，每孔加200?ul含1000?U/ml?IL-2，0.5?mg/l?6-TG，來自自體的20%淋巴細胞刺激液和1×10⁶個滋養(yǎng)細胞，?20%小牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)液，種2×10⁴個靶細胞,每個樣本共種1×10⁶個細胞。另一組則不加滋養(yǎng)細胞，其余均同上。隨后克隆板和篩選板均置于37℃，5%?CO2培養(yǎng)箱中，6天半量更換含淋巴細胞刺激液的培養(yǎng)液，培養(yǎng)15-18天后計數(shù)克隆。