[發(fā)明專利]一種檢測附子中二萜類生物堿在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)含量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110002644.0
• 申請(qǐng)日: 2011-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN102590404A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉志強(qiáng);韓天嬌;宋鳳瑞;鄭重;邢俊鵬;劉淑瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G01N30/72
• 分類號(hào): G01N30/72;G01N30/06
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 魏曉波;逯長明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于中藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測附子中二萜類生物堿在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)含量的方法。

背景技術(shù)

Caco-2細(xì)胞模型(the?human?colon?carcinoma?cell?line)是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，Caco-2細(xì)胞可在培養(yǎng)條件下自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化并可以形成緊密聯(lián)結(jié)，分化出絨毛面AP(apical，腸腔側(cè))和基底面BL(basolateral，腸壁側(cè))，其形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)、滲透特征等與小腸上皮細(xì)胞相似，因此可以作為研究小腸表皮細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和代謝的體外模型。

Caco-2單層細(xì)胞模型被認(rèn)為是研究口服藥物在小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的較好的體外模型，其與藥物在腸中的吸收具有良好的相關(guān)性、重現(xiàn)性及適用性，已被美國食品和藥物管理局(Food?and?Drug?Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)使用進(jìn)行藥物篩選。如，Artursson?P等(Artursson?P，Karlsson?J.，Correlation?between?oraldrug?absorbtion?in?human?and?apparent?drug?permeability?coefficients?in?humanintestinal?epithelial?cells[J]，biochem?Biophys?Res?Communication，1991，175(3)：880～885)用Caco-2細(xì)胞模型研究了屬被動(dòng)擴(kuò)散的20種不同結(jié)構(gòu)的藥物吸收機(jī)制，通過小腸表皮細(xì)胞的吸收，測定了這些藥物的表觀通透系數(shù)(Apparentpermeability?coefficient，P_app)，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞模型所得結(jié)果與人體吸收程度的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：P_app值大于1*10^-6時(shí)，藥物完全吸收；P_aap值在(0.1～1.0)*10^-6之間時(shí)，藥物吸收介于1％～100％，P_aap值小于1*10^-7時(shí)，藥物吸收小于1％；Yee?S(Yee?S，In?vitro?permeability?across?Caco-2?cells?can?predict?in?vivo(smallintestinal)absorption?in?manfact?or?myth[J]，Phamaceut?Res，1997，14(6)：763～766)利用Caco-2細(xì)胞模型研究了在人體具有不同吸收程度的35種化合物，并分別測定了其P_app，發(fā)現(xiàn)該系數(shù)與人體吸收相關(guān)程度良好。

附子(Radix?Aconiti?Lateralis?Preparata)為毛茛科烏頭屬植物川烏頭的側(cè)根，是中醫(yī)臨床常用中藥，性味甘、辛、大熱有毒，具有鎮(zhèn)痛、消炎、強(qiáng)心和抗癌等廣泛的藥理作用，被認(rèn)為是中藥中的“回陽救逆第一品”。附子的主要化學(xué)成分是二萜類生物堿，主要包括雙酯型生物堿、單酯型生物堿和醇胺型生物堿，如塔拉烏頭胺(talatizamine)、新烏寧堿(neoline)、附子寧堿(fuziline)、14-苯甲酰次烏頭胺(14-benzoylhypaconine)、14-苯甲酰中烏頭胺(14-benzoylmesaconine)、次烏頭堿(hypaconitine)、去氧烏頭堿(deoxyaconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)、烏頭堿(aconitine)、10-羥基-中烏頭堿(10-OH-mesaconitine)和10-羥基-烏頭堿(10-OH-aconitine)等。

利用Caco-2細(xì)胞模型對(duì)附子中的二萜類生物堿進(jìn)行吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要對(duì)其吸收轉(zhuǎn)運(yùn)含量進(jìn)行檢測，而現(xiàn)有的檢測方法并不適用于含有11種以上的生物堿的附子。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測附子中二萜類生物堿在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)含量的方法，本發(fā)明提供的檢測方法能夠檢測附子中11種生物堿在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)含量，操作簡便、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高。

本發(fā)明提供了一種檢測附子中二萜類生物堿在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)含量的方法，包括以下步驟：

a)提取附子中的二萜類生物堿，得到生物堿提取物；

b)將所述生物堿提取物溶解于Hanks平衡鹽緩沖液中，將得到的溶液作為供給側(cè)、Hanks平衡鹽緩沖液作為接收側(cè)在Caco-2細(xì)胞模型中進(jìn)行吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，自接收側(cè)取樣，得到待測樣品；