[發(fā)明專利]用于檢測水產(chǎn)品中重要致病菌的核苷酸及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110000661.0
• 申請日: 2011-01-04
• 公開（公告）號: CN102140515A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王磊;李榮榮;張戀心;曹勃陽;馮露
• 申請（專利權(quán)）人: 天津生物芯片技術(shù)有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測用核苷酸及其應(yīng)用，尤其涉及檢測水產(chǎn)品中重要致病菌特異的核苷酸及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

食品質(zhì)量與食品安全關(guān)系人類健康，因而受到世界各國的高度重視。微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要問題。細菌污染造成的食源性疾病(食物中毒)是我國食品安全中最突出的問題。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計，2000年共收到重大食物報告達150起，中毒6237人，死亡135人；2001年共發(fā)生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，116人死亡。2005年全國各地上報的食物中毒事件中，微生物食物中毒人數(shù)最多，占總數(shù)的43.0％。國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)個案報告的資料分析表明：微生物性病原占46.4％，微生物性食源性疾病暴發(fā)中，副溶血性弧菌導致的疾病暴發(fā)占40.1％，變形桿菌占11.3％，葡萄球菌腸毒素占9.4％，沙門氏菌占8.1％，致病性大腸桿菌占4％。我國食物中毒的高危食品為：肉類、糧食、水產(chǎn)品、水果蔬菜、雞蛋、豆類、奶。這一排序是基于國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)部分資料的分析的動態(tài)情況。其中水產(chǎn)品排名第三，是重要的食物中毒高危食品。水產(chǎn)品致病菌導致的食源性疾病影響的國家范圍廣、危急健康人群多，而且還給國家之間相關(guān)的食品貿(mào)易帶來危機，這使得水產(chǎn)品安全問題受到了空前的關(guān)注。這些事實也可以充分說明盡管現(xiàn)代科技已經(jīng)發(fā)展到了相當高的水平，但水產(chǎn)品致病菌導致的疾病不論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，都沒有很好的被控制，仍然危害著人民的健康。

水產(chǎn)品中的致病菌主要有以下兩類：一是其自身原有致病菌，這類細菌廣泛分布于水中，如冷源性細菌單核細胞增生李斯特氏菌，噬熱性細菌如副溶血弧菌和霍亂弧菌等；二是非自身原有致病菌，即生產(chǎn)過程中被污染的致病菌，主要存在與人和動物腸道內(nèi)及被人或動物糞便污染的水環(huán)境中，常見的包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等(楊文鴿，孫翠玲，潘云娣，等，水產(chǎn)品中致病微生物的快速檢測方法，中國食品學報，2006，6(1)：402～406)。統(tǒng)計了衛(wèi)生部公布的國內(nèi)近十年公布的微生物性食物中毒病例，綜合國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)部分資料的分析的動態(tài)情況，天津出入境檢驗檢疫局提供的調(diào)查統(tǒng)計數(shù)據(jù)，確定水產(chǎn)品致病菌檢測芯片檢測范圍為下列常見的8類菌：沙門氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌(包含福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鮑氏志賀菌和痢疾志賀氏菌共4個種)。

我國目前對于水產(chǎn)品的病原菌檢測、鑒定手段仍停留常規(guī)的微生物學檢驗水平，通常以分離培養(yǎng)、生化試驗及血清學試驗為主，具有操作復(fù)雜、手工勞動量大、檢驗周期長(6-7天)、特異性不強等缺點，在相當大的程度上限制了對食源性疾病病源水產(chǎn)品的快速檢測鑒定能力，并且在判斷是否為陽性時只靠實驗人員肉眼觀察，沒有足夠可靠的依據(jù)，其結(jié)果是降低了實驗結(jié)果的準確性，不能達到新鮮水產(chǎn)品貯藏時間短、需要快速檢測的要求。一些簡單的分子生物學的方法如PCR、ELISA都有較高的假陽性結(jié)果出現(xiàn)，并且運用PCR和ELISA得出的結(jié)果都不能作為最終的檢測依據(jù)。日前丹麥、澳人利亞等一些歐洲和澳洲國家食源性病原菌的檢測結(jié)果綜合了實時熒光PCR和ELISA兩種技術(shù)在DNA和蛋白質(zhì)兩種水平上檢測的結(jié)果進行判斷，并且實驗操作只有1h左右。因此我國有必要建立起水產(chǎn)品致病菌的高通量、快速、準確的監(jiān)測體系，以確保在相對較短的時間內(nèi)正確判定水產(chǎn)品的安全性，這是有效地預(yù)防和控制食源性疾病的重要前提。只有這樣才能在一定程度上提前消除由于水產(chǎn)品中的致病菌所造成的危害，提高我國食源性疾病的檢測和控制能力，為加入WTO后盡早與其他國家達成通關(guān)協(xié)議搭建雄厚的技術(shù)平臺。

聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(Polymerase?chain?reaction，簡稱PCR技術(shù))作為微生物檢測的技術(shù)目前正在得到認同和推廣，該技術(shù)相對于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，只需對樣品進行簡單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，實現(xiàn)檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需2個小時。這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測水產(chǎn)品中重要致病菌的核苷酸及其試劑盒，以彌補傳統(tǒng)常見水產(chǎn)品致病菌檢測技術(shù)存在的費時耗力的缺陷，擴展病原菌檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強度，縮短檢測周期。

本發(fā)明提供的用于檢測水產(chǎn)品中重要致病菌的核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包含從以下核苷酸序列中選取的一種或多種：