[發明專利]用于減少病毒組合物中DNA雜質的方法

有效

• 申請號: 201080068497.0
• 申請日: 2010-08-12
• 公開（公告）號: CN103052399A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 張譯;代金明;倪亞瑾
• 申請（專利權）人: 依生生物制藥控股有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61K39/205;A61P31/14;C12N7/02;C12R1/93
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

技術領域

本發明通常涉及疫苗的制造，特別是病毒的純化，以及更特別是通過從用于病毒增殖的細胞基質中消除殘余DNA而實現的病毒純化。尤其是，本發明涉及使用傳代細胞系的病毒生產，特別是使用Vero細胞。生產過程可包括收獲目標病毒顆粒、凈化病毒組合物、滅活病毒以及將病毒組合物與具有高離子強度溶液混合，隨后通過體積排阻色譜的進一步純化。本發明適用于醫學產品（如用于人和動物的疫苗）制造的病毒生產，且特別是狂犬病病毒的生產。

背景技術

1介紹

改造的病毒顆粒可用于多種人類醫學應用，比如疫苗。在這種情況下，需要對所用病毒組合物進行純化，從而消除潛在的醫學風險，比如由不需要的雜質而引起的副作用，或將副作用最大程度降低至可接受的水平。純化過程包括去除包括源自用于培養病毒的細胞基質中不期望的殘余DNA片段的各種雜質。然而，純化過程必須生產出符合最嚴苛的監管安全標準的產品，所用的純化方法不得降低病毒本身的醫用性質，還不應使得生產過程是非經濟有效的，以避免最終的醫學產品變得價格過高。

依賴于使用核酸酶或化學試劑的純化技術，將殘余DNA降解為極小的片段，以至于不能引起明顯臨床風險，但這可能導致病毒顆粒的降解，繼而不利地降低目標病毒的免疫原性。各種過濾、離心及其它凈化病毒溶液的技術依賴于所需病毒相較于不期望的雜質之間差異的物理性質（比如尺寸重量、密度等），可能無法完全除去DNA以至于達到滿足醫學產品監管標準的水平。

純化技術如離子色譜法等依賴于同病毒顆粒與不期望的雜質相關的電荷差異，這種方法可導致生產產量低，因而生產成本高。

本發明提供了一種成本有效的方式來標準化批量生產高純病毒組合物，同時保留病毒顆粒的免疫原性。因此，本發明滿足了生產高品質、高療效且實惠的病毒組合物的需求，病毒組合物可滿足安全和有效的國際監管標準，并因此適用于人類醫學應用。

45年多以來，使用源自各種來源的原代細胞來增殖用于疫苗的病毒，來源包括：雞胚胎以及猴、狗、兔和倉鼠腎臟細胞。雖然這些制造過程所生產的產品用于人類使用被認為是安全的，但是潛在的傳染性病原體污染、個體動物之間的不一致性以及收集動物細胞的倫理敏感性導致對替代細胞基質的尋求。

發現二倍體細胞克服原代細胞中觀察到的許多缺點。二倍體細胞的耐受性好、無致腫瘤性、染色體變異的頻率低以及連續增殖的能力有限。然而，二倍體細胞難以用于批量生產而且成功的使用二倍體細胞對環境條件的要求更加嚴苛。

傳代細胞系，第三類細胞基質，逐漸成為病毒生產的優選選擇。傳代細胞系的優勢是無限生產標準且特征清晰的細胞，這些細胞生長快速并可用在生物反應器中大規模生產病毒。WHO建立了Vero細胞的主細胞庫，Vero細胞是一種源自非洲綠猴腎臟的傳代細胞系，被認為有助于疫苗抗原生產的細胞系（WHO技術報告747?1987）。

然而，傳代細胞系本身和一些涉及其醫學目的的用途的相關缺點。殘余DNA可能會整合入宿主基因組中，可潛在地導致宿主/接受者DNA的惡性轉化，導致細胞復制中的異常比如癌癥。

有4個影響風險程度的因素：細胞基質本身，不同類型具有不同的安全性譜、DNA片段的尺寸，即200個堿基對以下通常小于功能基因的尺寸、施用途徑，即通過口服DNA攝取的效率相對于腸胃外施用組合物的效率低約10000倍、以及存在的DNA濃度。

FDA聯邦法規法典第21篇（title）第610.13部分對生物產品的普遍標準規定“產品應不含外源性材料，除非它是在已批準的生物許可應用中所描述的制造過程中所不能避免的”。WHO和國家監管機構也發布了具體的條例或指南，專門控制源自使用傳代細胞系的生產過程的疫苗抗原中的DNA含量水平。

WHO專家委員會在1998年發表的關于生物學標準化技術報告878總結道“當這種DNA的量等于或少于100pg每腸胃外劑量時，在產品中和殘余傳代細胞系DNA相關的風險是可以忽略的”。委員會評估的結論為每疫苗純化劑量中10ng以內的殘余傳代細胞系DNA視為是可接受的。

歐洲藥品評價局專利藥品委員會于2001年發表了關于使用人源致腫瘤性細胞生產生物和生物技術醫學產品的立場聲明，其引用了WHO的上述結論，但是還注明WHO報告所指出的當臨床風險可能性較高時，例如，當殘余DNA可含有感染性逆轉錄酶病毒前病毒體序列時，可發生意外。報告結論是成品中所允許的DNA水平“應盡可能低”，且以具體案例的風險因素評估為基礎。