[發(fā)明專利]新的超靈敏的基于細(xì)胞的傳感器及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080068285.2
• 申請日: 2010-07-28
• 公開（公告）號(hào): CN103154731A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 埃利耶·帕斯-羅哈斯;瑪麗亞·德·格拉西亞·蒙特羅-佩尼亞爾沃;韋羅妮卡·馬庫拉達(dá)·盧納-格雷羅;費(fèi)·伊莎貝爾·加西亞·馬塞拉;何塞·安德列斯·莫拉萊斯-馬丁內(nèi)斯;塔尼亞·加西亞·馬塞拉;安娜·貝倫·阿拉貢-戈麥斯;安娜·克薩達(dá)-莫利納;奧羅拉·瑪麗亞·馬克斯-莫拉萊斯
• 申請（專利權(quán)）人: 坎瓦克斯生物技術(shù)公司
• 主分類號(hào): G01N33/50
• 分類號(hào): G01N33/50
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 張國梁

1.基于細(xì)胞的傳感器，其包括：

a具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的造血細(xì)胞系，

b蛋白酶報(bào)道分子，其轉(zhuǎn)染到(a)所述細(xì)胞系中，存儲(chǔ)在所述細(xì)胞系的分泌顆粒中，

c(a)所述細(xì)胞系的分泌顆粒的受控胞吐作用的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑或轉(zhuǎn)染的異源性調(diào)節(jié)劑，

d用于檢測所述分泌顆粒存儲(chǔ)的蛋白酶報(bào)道分子的特異性底物。

2.權(quán)利要求1的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述具有分泌顆粒的專職受控胞吐作用的細(xì)胞系是造血細(xì)胞系和/或它們的后代，其選自由髓樣細(xì)胞系組成的組，或選自由淋巴樣細(xì)胞系組成的組，所述髓樣細(xì)胞系包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板和樹突細(xì)胞，所述淋巴樣細(xì)胞系包括T-細(xì)胞、B-細(xì)胞和NK-細(xì)胞。

3.權(quán)利要求1-2的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的組：大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系RBL-2H3、小鼠骨髓造血細(xì)胞系32D、天然殺傷細(xì)胞系人NK92細(xì)胞系、天然殺傷細(xì)胞系人YT細(xì)胞系和小鼠肥大細(xì)胞小鼠MC/9細(xì)胞系。

4.權(quán)利要求1-3的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述胞吐作用調(diào)節(jié)劑是多肽，所述多肽在被活化或抑制時(shí)誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣、cAMP、二酰甘油(DAG)磷脂或ATP水平變化，其轉(zhuǎn)而控制或調(diào)節(jié)鈣觸發(fā)的胞吐作用。

5.權(quán)利要求1-4的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述受控分泌顆粒胞吐作用調(diào)節(jié)劑是內(nèi)源性表面受體或轉(zhuǎn)染的異源性表面受體。

6.權(quán)利要求5的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述表面受體選自由以下各項(xiàng)組成的組：G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、攜帶ITAM基序的受體、攜帶ITIM基序的受體和蛋白酪氨酸激酶受體。

7.權(quán)利要求1-6的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述受控分泌顆粒胞吐作用調(diào)節(jié)劑是嵌合受體，其包括：(a)具有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)和(b)包含ITAM序列的Fc受體的至少跨膜和胞內(nèi)區(qū)，用于在胞外區(qū)配體結(jié)合誘導(dǎo)受體寡聚化之后增加胞內(nèi)鈣。

8.權(quán)利要求1-7的基于細(xì)胞的傳感器，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至所述細(xì)胞系中并存儲(chǔ)在所述分泌顆粒中的蛋白酶報(bào)道分子是多肽，所述多肽對造血細(xì)胞顆粒內(nèi)部的蛋白質(zhì)水解和低pH環(huán)境具有抗性。

9.權(quán)利要求8的基于細(xì)胞的傳感器，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至所述細(xì)胞系中的、由分泌顆粒存儲(chǔ)的蛋白酶報(bào)道分子是絲氨酸蛋白酶。

10.權(quán)利要求9的基于細(xì)胞的傳感器，其中絲氨酸蛋白酶選自由天然存儲(chǔ)在造血細(xì)胞顆粒中的絲氨酸蛋白酶組成的組，包括具有在天冬氨酸后切割的天冬裂酶樣活性的酶；具有在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸后切割的胃促胰酶-樣活性的酶；具有在賴氨酸或精氨酸后切割的類胰蛋白酶-樣活性的酶或具有在纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸或半胱氨酸后切割的彈性蛋白酶-樣活性的酶。

11.權(quán)利要求8-10的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述絲氨酸蛋白酶是選自由以下各項(xiàng)組成的組的粒酶：人粒酶A、B、H、K和M、鼠粒酶A、B、C、D、E、F、G、K、M、L和N；牛粒酶B、黑猩猩粒酶B、短尾負(fù)鼠粒酶B和馬粒酶B。

12.權(quán)利要求8-10的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述絲氨酸蛋白酶選自人胃促胰酶、人組織蛋白酶G、人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和人蛋白酶3。

13.權(quán)利要求1-12的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述顆粒存儲(chǔ)的蛋白酶報(bào)道分子是來自人、大鼠、黑猩猩和/或馬物種的粒酶B，且用于檢測報(bào)道分子胞吐作用的底物包括處于P4的選自異亮氨酸或纈氨酸的氨基酸；處于P3的選自谷氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸的氨基酸；處于P2的選自脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酸、甘氨酸或組氨酸的氨基酸，和處于P1的天冬氨酸。

14.權(quán)利要求13的基于細(xì)胞的傳感器，其中所述底物還包括處于P1`的選自纈氨酸、絲氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的不帶電氨基酸和處于P2′的選自絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸的氨基酸。