[發(fā)明專利]用于核酸定量分析的反應(yīng)器

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080065414.2
• 申請(qǐng)日: 2010-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN102791882A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: Z.孫;T.潘;X.劉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 霍尼韋爾國際公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;B01L3/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 趙蘇林;楊思捷

發(fā)明背景

在生物分析和新出現(xiàn)的基因組學(xué)領(lǐng)域中目前使用的重要技術(shù)是DNA的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。由于這種有力工具，可以從否則無法檢測(cè)量的DNA開始且產(chǎn)生用于后續(xù)分析的大量材料。PCR使用重復(fù)系列的步驟以產(chǎn)生位于兩個(gè)起始（“引物”）序列之間的多核苷酸序列拷貝。從模板、兩個(gè)引物序列（通常長度約15-30個(gè)核苷酸）、PCR緩沖液、游離脫氧核苷三磷酸（dNTPs）和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（通常為來自棲熱水生菌（Thermus?aquaticus）的TAQ聚合酶）開始，將這些組分混合，并且加熱以分離雙鏈DNA。后續(xù)冷卻步驟允許引物對(duì)于含有待擴(kuò)增序列的單鏈DNA分子上的互補(bǔ)序列退火。靶序列的復(fù)制通過DNA聚合酶完成，這產(chǎn)生與模板互補(bǔ)的DNA鏈。這個(gè)過程的重復(fù)加倍目的序列的拷貝數(shù)，并且多重循環(huán)指數(shù)增加拷貝數(shù)。

因?yàn)镻CR要求在較高和較低溫度之間的重復(fù)循環(huán)，所以PCR裝置必須由能夠經(jīng)得住此類溫度變化的材料制造。材料必須是在高溫機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定的，并且能夠經(jīng)得住反復(fù)的溫度變化而無機(jī)械降解。此外，材料必須與PCR反應(yīng)自身相容，并且不抑制聚合酶或結(jié)合DNA。

常規(guī)PCR一般在管、微板和毛細(xì)管中進(jìn)行，所有這些可以方便地密封。然而，這些管、微板和毛細(xì)管的幾何學(xué)致使其不適合于漸消波檢測(cè)法（evanescent?wave?detection?method）。

當(dāng)使用漸消波檢測(cè)法時(shí)，存在增加信噪比的兩種常見策略。一種方法增加實(shí)際雜交信號(hào)。另一種方法減少本底信號(hào)。

存在可以用于增加實(shí)際雜交信號(hào)的多種技術(shù)方案。一種已知方案利用更靈敏的熒光標(biāo)記。另一種已知方案通過修飾暴露條件如緩沖液組成和溫度、或使用具有高信噪比的檢測(cè)器來增加雜交效率。

然而，這些技術(shù)方案不能完全解決問題或引起其他有疑問的結(jié)果。作為例子，使用更靈敏的熒光標(biāo)記還可以增加本底噪聲。此外，改變暴露條件可以減少擴(kuò)增效率，并且高品質(zhì)檢測(cè)器一般是成本高得驚人的。

與漸消波傳感中的高本底信號(hào)有關(guān)的某些原因和方案已在幾個(gè)技術(shù)文件中加以討論。作為例子，M.?Yoshida等人1993?Meas.?Sci.?Technol.4?1077-1079描述了至更長的激發(fā)波長過程的轉(zhuǎn)變，以便將靈敏度增加比常規(guī)系統(tǒng)中獲得那種高的數(shù)量級(jí)。此外，基底的小平面可以精細(xì)拋光以便減少在光學(xué)基底表面上的散射。WO?2008/092291?Al還描述了多層反射或吸收涂層可以如何涂覆在基底底部上的粘附區(qū)域上，以阻止通過粘合劑引起的任何散射。

上述方案僅能夠消除在反應(yīng)緩沖液內(nèi)生成的某些不需要的熒光本底信號(hào)，在所述反應(yīng)緩沖液中存在高濃度熒光分子。其余不需要的熒光本底信號(hào)一般來自四個(gè)不同方面。

一個(gè)方面是檢測(cè)器的固有噪聲。這個(gè)方面非常難以消除。

第二個(gè)方面來自在蓋板和反應(yīng)緩沖液之間的界面。該界面引起在熒光標(biāo)記的DNA分子和蓋板表面之間的非特異性結(jié)合。已作出通過多種表面修飾法減少非特異性結(jié)合的嘗試，這增加蓋板表面的惰性特征（例如通過預(yù)雜交）。參見通過Alan?R.?Kimmel，Brian?Oliver的Methods?in?Enzymology:?DNA?Microarrays，第410卷，第157頁。

第三個(gè)方面涉及反應(yīng)緩沖液內(nèi)，在其中存在激發(fā)光的散射，從而使得激發(fā)光以不同方向傳送進(jìn)入反應(yīng)緩沖液內(nèi)。散射的激發(fā)光在蓋板和反應(yīng)之間的界面上未獲得完全反射，而是引起反應(yīng)緩沖液內(nèi)的熒光分子的激發(fā)/發(fā)射。WO?2008/092291?Al描述了通過拋光或使用多層反射或吸收涂層來修飾蓋板，以阻止散射。

附圖簡(jiǎn)述

本發(fā)明的實(shí)施方案可以通過參考舉例說明此類實(shí)施方案的下述說明書和附圖得到最佳理解。在附圖中：

圖1舉例說明了能夠漸消波檢測(cè)微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的藥筒（cartridge）視圖。

圖2舉例說明了能夠漸消波檢測(cè)微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的藥筒側(cè)視圖。

圖3舉例說明了能夠漸消波檢測(cè)微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的另一個(gè)藥筒視圖。

圖4舉例說明了能夠漸消波檢測(cè)微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的另一個(gè)藥筒側(cè)視圖。

圖5舉例說明了基于漸消波檢測(cè)操作的示例微陣列閱讀器的斷面視圖。

圖6舉例說明了通過CCD檢測(cè)器捕獲的圖像，所述CCD檢測(cè)器舉例說明了兩個(gè)不同蓋板的完全熒光本底，其中一個(gè)蓋板由K9玻璃形成，并且另一個(gè)蓋板由石英制成。