[發明專利]用于在巰基-二硫鍵氧還酶缺陷的細菌突變體細胞中產生異源多肽的方法

無效

• 申請號: 201080064301.0
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102762723A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: W.韋德納;B.克里斯坦森
• 申請（專利權）人: 諾維信股份有限公司;諾維信公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/75;C12N15/53;C12P21/02;C07K14/32
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 史悅

1.一種親本細菌細胞的分離的突變體，包含編碼包含兩個或更多個(幾個)半胱氨酸的異源多肽的第一多核苷酸，和包含編碼不正確地催化所述異源多肽的兩個或更多個(幾個)半胱氨酸之間的一個或多個(幾個)二硫鍵形成的巰基-二硫鍵氧還酶的基因的修飾的第二多核苷酸，其中所述突變體細胞在相同條件下培養時相對于親本細菌細胞在巰基-二硫鍵氧還酶產生方面是缺陷的。

2.權利要求1的突變體，其中所述巰基-二硫鍵氧還酶基因選自下組：

(a)編碼巰基-二硫鍵氧還酶的基因，所述巰基-二硫鍵氧還酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ?ID?NO:2，SEQ?ID?NO:4，SEQ?ID?NO:50，SEQ?ID?NO:52，SEQ?ID?NO:54，SEQ?ID?NO:56，SEQ?ID?NO:58，SEQ?ID?NO:60，SEQ?ID?NO:62，SEQ?ID?NO:64，SEQ?ID?NO:66，或SEQ?ID?NO:68；或其成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；

(b)編碼巰基-二硫鍵氧還酶的基因，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在至少低嚴格條件，例如中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件或非常高嚴格條件下與SEQ?ID?NO:1，SEQ?ID?NO:3，SEQ?ID?NO:49，SEQ?ID?NO:51，SEQ?ID?NO:53，SEQ?ID?NO:55，SEQ?ID?NO:57，SEQ?ID?NO:59，SEQ?ID?NO:61，SEQ?ID?NO:63，SEQ?ID?NO:65，或SEQ?ID?NO:67；其成熟多肽編碼序列；或其全長互補鏈雜交；和

(c)編碼巰基-二硫鍵氧還酶的基因，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1，SEQ?ID?NO:3，SEQ?ID?NO:49，SEQ?ID?NO:51，SEQ?ID?NO:53，SEQ?ID?NO:55，SEQ?ID?NO:57，SEQ?ID?NO:59，SEQ?ID?NO:61，SEQ?ID?NO:63，SEQ?ID?NO:65，或SEQ?ID?NO:67；或其成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。

3.權利要求1或2的突變體，其中所述第一多核苷酸編碼的多肽是抗原、酶、生長因子、激素、免疫調節劑(immunodilator)、神經遞質、受體、報道蛋白、結構蛋白或轉錄因子。

4.權利要求1-3任一項的突變體，其中所述親本細菌細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞。

5.權利要求4的突變體，其中所述芽孢桿菌屬細胞是枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)細胞或地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)細胞。

6.權利要求1-5任一項的突變體，其在相同條件下培養時，與親本細菌細胞相比產生至少約25%更少的所述巰基-二硫鍵氧還酶，或不產生可檢測到的所述巰基-二硫鍵氧還酶。

7.一種產生異源多肽的方法，包括：

(a)在用于產生所述異源多肽的培養基中培養權利要求1-6任一項的突變體；和

(b)從培養基回收所述異源多肽。

8.一種獲得親本細菌細胞的突變體的方法，包括：

(a)向所述親本細菌細胞導入編碼包含兩個或更多個(幾個)半胱氨酸的異源多肽的第一多核苷酸，和包含編碼不正確地催化所述異源多肽的兩個或更多個(幾個)半胱氨酸之間的一個或多個(幾個)二硫鍵形成的巰基-二硫鍵氧還酶的基因的修飾的第二多核苷酸；和

(b)鑒定包含修飾的多核苷酸的來自步驟(a)的突變體細胞，其中所述突變體細胞在巰基-二硫鍵氧還酶產生方面是缺陷的。