[發明專利]用于控制歐洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的殺蟲蛋白組合，和管理昆蟲抗性的方法

在審

• 申請號: 201080064008.4
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102762095A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: T.米德;K.納瓦;N.P.斯托爾;J.J.希茨;A.T.伍斯利;S.L.伯頓
• 申請（專利權）人: 陶氏益農公司
• 主分類號: A01H5/00
• 分類號: A01H5/00;A61K36/899
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

發明背景

人類種植玉米以用于食物和能量的供應。昆蟲吃并損害植物從而破壞這些人類的努力。

目前已經通過植物表達編碼來自蘇云金芽孢桿菌的Cry1Fa蛋白的晶體(Cry)內毒素基因而實現了這些害蟲的植物內轉基因控制。Cry1Fa是目前Dow?AgroSciences的Herculex^TM品牌下的轉基因玉米種子(Herculex，Herculex-Extra，和Herculex-RW)中的毒素蛋白，其對FAW和ECB昆蟲害蟲有抗性。該蛋白通過結合至位于昆蟲中腸內的特定受體并在腸細胞上形成孔而起作用。這些孔的形成阻止昆蟲調節滲透壓平衡并導致其死亡。

然而，存在一些情況，即昆蟲可能能夠通過其腸道中結合Cry1Fa的受體的遺傳改變而發展對Cry1Fa活性的抗性。產生具有降低的結合Cry1Fa能力的受體的昆蟲會對Cry1Fa的活性有抗性，從而在表達該蛋白的植物中存活。

當植物在生長狀態期間持續表達單一的Cry毒素時，有這種情況，即昆蟲可以通過昆蟲腸道內的結合Cry1Fa毒素的受體的遺傳改變而發展對該蛋白的活性的抗性。由受體的這些改變而引起的毒素結合的降低會導致Cry1Fa毒性的降低，并可能導致最終作物中表達的蛋白的效力降低。

發明概述

本發明部分地涉及疊加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特別是玉米)(corn?or?maize)更持久并更少的傾向于允許昆蟲發展對這兩種毒素的任意一種的活性的抗性。這些疊加可以特別用于靶標歐洲玉米螟(ECB)。

發明詳述

本發明部分地涉及疊加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特別是玉米)更持久并更少的傾向于允許昆蟲發展對這兩種毒素的任意一種的活性的抗性。這些疊加可以特別用于靶標歐洲玉米螟(ECB，Ostrinia?nubilalis)。

本發明也部分涉及三倍疊加或三種(或更多)蛋白毒素的“金字塔”，由Cry1Ab和Cry2Aa毒素作為基礎對。(“分離的活性位點”，意思是給定的蛋白的任何一個不引起相互之間的交叉抗性。)增加靶向ECB的第三種蛋白能提供具有針對ECB的行為的第三個位點的蛋白。在一些優選的實施方式里，第三個蛋白可以選自DIG-3(參見US?2010-00269223)，Cry1I，Cry1Be，Cry2Aa，和Cry1Fa。參見例如USSN?61/284,278，提交于2009年12月16日。也參見US2008-0311096。

從而，在一些優選的金字塔實施方式里，選擇的毒素具有針對ECB的作用的分離的位點。此外，優選的金字塔組合為本發明的蛋白對加第三個IRM蛋白。

本發明的對或三倍疊加(對ECB活性)也可以與另外的蛋白組合——例如靶向秋粘蟲(FAW)。這樣的蛋白包括例如Vip3，Cry1C，Cry1D，和/或Cry1E。Cry1Be和/或Cry1Fa也可以用于靶向FAW和ECB。

GENBANK可以用于獲得本文公開或提及的任何基因和蛋白的序列。參見附錄A。

本發明也涉及三種殺蟲蛋白(在一些優選實施方式里是Cry蛋白)，其對單一的靶標害蟲有活性，但是不導致相互之間的交叉抗性。

生產這三種(至少)毒素的植物(和種植該植物的面積)也包含在本發明的范圍之內。也可以加入其它的毒素/基因，但是這些特別的三倍疊加根據本發明可以便利地和令人驚訝地提供針對ECB的活性的三個位點。

本發明的對或三倍疊加(和/或其它蛋白的組合)能有助于減少或消除對避難所面積的需求(即，少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或甚至0%的避難所)。從而種植了超過10英畝的田地也包含在本發明之內。提供的多核苷酸優選在遺傳構建體中并在非蘇云金芽孢桿菌啟動子的控制之下。提供的多核苷酸可以包含用于在植物中增強表達的密碼子。

為了阻礙昆蟲發展針對Cry蛋白的抗性的能力，我們鑒別了不競爭性結合至ECB腸受體蛋白的Cry毒素。發現Cry1Ab不取代結合至位于ECB幼蟲的昆蟲腸道中的受體的Cry2Aa。

我們發現Cry2Aa和Cry1Ab對ECB幼蟲是毒性的，然而它們不完全與同樣的受體位點結合；這顯示它們的毒性不會在ECB中提供交叉抗性。