[發(fā)明專利]缺氧調(diào)節(jié)的條件沉默性AAV表達(dá)血管生成誘導(dǎo)因子

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080060561.0
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN102712920A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: K·A·韋伯斯特
• 申請（專利權(quán)）人: 邁阿密大學(xué)
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2009年10月39日提交的美國臨時(shí)申請第61/256,381號的優(yōu)先權(quán)，其通過引用全文納入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明的實(shí)施方式包括治療組織缺氧和相關(guān)情況。具體地，通過表達(dá)所需因子的條件沉默載體表達(dá)在患者中誘導(dǎo)定向治療性血管生成。

背景技術(shù)

治療血管生成是開發(fā)用于治療缺血的方法，其中在缺血組織中響應(yīng)由基因或者細(xì)胞遞送的外源血管生成因子而誘導(dǎo)新血管生長。主要的臨床目標(biāo)是由冠狀和外周動(dòng)脈疾病分別造成的心肌和重癥下肢缺血。基因和前體干細(xì)胞的有說服力的臨床結(jié)果產(chǎn)生一系列的II/III期臨床試驗(yàn)。這些只是適度成功，顯示了程序的安全性，但療效最小。

發(fā)明內(nèi)容

此總結(jié)提供本發(fā)明的概要以簡要說明發(fā)明的性質(zhì)和物質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解的是，它不會(huì)用于解釋或限制所附權(quán)利要求的范圍或意義。

優(yōu)選實(shí)施方式包括促進(jìn)選擇性定向動(dòng)脈發(fā)生的載體，其在一些實(shí)施方式中由缺氧調(diào)節(jié)的條件沉默性AAV載體來專門驅(qū)動(dòng)。這些組合物由強(qiáng)烈組織缺氧調(diào)控的NRSE和TOAD/FROG沉默元件組合的生長因子表達(dá)來提供更快、更高效血管重生和組織恢復(fù)。提供了方法，其中，生長因子基因表達(dá)的條件沉默提供以條件沉默程度決定的定向動(dòng)脈發(fā)生。這產(chǎn)生缺血組織的高效血管重生，其也由條件沉默的程度來決定。

在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，包含F(xiàn)ROG/TOAD和NRSE沉默子的載體賦予組織缺氧的強(qiáng)烈調(diào)控和由三個(gè)沉默元件(NRSE/FROG/TOAD)組合影響的最大反應(yīng)的更迅速血管重生。這三個(gè)異源沉默元件的意外屬性可能歸因于相較單獨(dú)NRSE相的多種不同細(xì)胞基因表達(dá)的沉默，其中沉默限于非神經(jīng)細(xì)胞，并且在干細(xì)胞中功能弱或者沒有。

在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，使用基因調(diào)控元件組合在包含永久遞送基因治療載體的骨骼肌和心肌缺血組織中選擇性表達(dá)促血管生成基因，從而基因的調(diào)控表達(dá)促進(jìn)引起肌肉再灌注的穩(wěn)定成熟血管的生長。

在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，調(diào)控系統(tǒng)遞送基因到靶細(xì)胞，包括骨骼和心臟肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、干細(xì)胞等。

其他方面在下文描述。

附圖簡要說明

圖1A-1E：組織缺氧調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。圖1A的示意圖顯示基因表達(dá)的條件沉默由NRSE組蛋白去乙酰化酶活性和HIF-1組蛋白乙酰化酶活性間的相互作用操作。圖1B-1D顯示條件沉默的基因調(diào)控。圖1B-1C：心肌細(xì)胞，HeLa細(xì)胞或者C2-C12骨骼肌細(xì)胞用所示AAV穿梭載體和內(nèi)部對照Renilla熒光素酶共同轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，培養(yǎng)物在有氧或缺氧(0.5％-1％氧氣)空氣下再孵育24小時(shí)，并收集以檢測熒光素酶表達(dá)。圖1D：C2C12肌細(xì)胞用PGK或CS-PGK引導(dǎo)的AAV-GFP轉(zhuǎn)染，并如所示暴露于空氣或缺氧情況下。圖1E：C2C12肌細(xì)胞用PGK或CS-PGK引導(dǎo)的AAV-VEGF轉(zhuǎn)染，并暴露于空氣或缺氧情況下，分泌的VEGF通過ELISA在24小時(shí)的培養(yǎng)基中檢測。

圖2A的示意圖顯示如圖2C所示的FROG，TOAD，和FROG+TOAD元件的序列。IRE是炎癥反應(yīng)元件(NFκ-B)。構(gòu)建體的其他成分與圖1A-1E中描述的NRSE構(gòu)建體相同。圖2B：C2C12細(xì)胞用由包含F(xiàn)ROG/TOAD元件+HRE的PGK啟動(dòng)子引導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。如圖1A-1E所述，細(xì)胞暴露于有氧或缺氧情況下孵育48小時(shí)。

圖3A-3C顯示CS-AAV對比腺病毒的后肢缺血再灌注。圖3A：在小鼠后肢中誘導(dǎo)局部缺血并且在手術(shù)后由肌肉注射遞送指定載體。對所述每組12只小鼠肢體進(jìn)行多至12周的每周多普勒(Doppler)掃描，然后每月掃描。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)殺死小鼠，肌肉用RT-PCR來定量hVEGF或固定和石蠟包埋以用于免疫染色。正方形(上部曲線)AAV-CS-VEGF：圓和三角形(下部曲線)腺病毒(Ad)低和高劑量。Ad-VEGF自動(dòng)切除的所有肢體；黃色箭頭指示6月康復(fù)的AAV肢體的流。圖3B：在指定次數(shù)(n＝3)肢體肌肉中用RT-PCR定量VEGF表達(dá)。圖3C：對比AAV-CS-VEGF(綠色)，AAV-PGK-VEGF(紅色)和PBS(低曲線)的后肢再灌注。方法如圖3A所示；兩個(gè)AAV載體都恢復(fù)流，但是流在CS-VEGF上恢復(fù)更快。

圖4顯示使用平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體對石蠟包埋組織部分的免疫染色，揭示12周后，AAV9-CS-VEGF處理相較AAV9-PGK-VEGF載體在后肢有顯著更大的血管(AAV9-PGK-VEGF通過組織缺氧經(jīng)內(nèi)源HRE調(diào)控，但是沒有條件沉默，調(diào)控降低)。