[發(fā)明專利]在缺乏二肽基氨肽酶活性的巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)治療性蛋白的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080060331.4
• 申請(qǐng)日: 2010-10-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102725396A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S.R.哈密爾頓;T.A.施塔黑姆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 默沙東公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/09
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李連濤;李進(jìn)

1.一種在酵母宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白的方法，其中所述宿主酵母細(xì)胞缺乏二肽基氨肽酶（DAP）活性，所述方法包括：a.?用編碼蛋白的多核苷酸載體轉(zhuǎn)化其中DAP活性已經(jīng)被去除的基因修飾的酵母細(xì)胞；b.?在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和c.?從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離蛋白。

2.權(quán)利要求1的方法，其中酵母細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）。

3.權(quán)利要求1或2的方法，其中通過(guò)從酵母細(xì)胞基因組中刪除或破壞STE?13和DAP2基因而去除DAP活性。

4.權(quán)利要求1的酵母，其中宿主細(xì)胞已經(jīng)被基因工程化以產(chǎn)生包含人樣N-聚糖的糖蛋白。

5.權(quán)利要求4的酵母，其中人樣N-聚糖選自雜合和復(fù)合的N-聚糖。

6.權(quán)利要求1的酵母，其中宿主細(xì)胞被基因工程化以產(chǎn)生主要具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖選自Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂、Gal_(1-4）G1cNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂和?NANA_（1-4）Gal_（1-4）GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂。

7.權(quán)利要求1的方法，其中酵母進(jìn)一步表達(dá)人糖蛋白。

8.一種缺乏二肽基氨肽酶（DAP）活性的基因修飾的酵母細(xì)胞，包括其中編碼STE13和DAP2的基因組DNA已被從酵母細(xì)胞基因組中刪除或破壞的酵母細(xì)胞系。

9.權(quán)利要求8的酵母細(xì)胞，其中酵母細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。

10.權(quán)利要求6的方法，其中宿主細(xì)胞已被基因工程化以產(chǎn)生包含人樣N-聚糖的糖蛋白。

11.權(quán)利要求10的方法，其中人樣N-聚糖選自雜合和復(fù)合的N-聚糖。

12.權(quán)利要求6的方法，其中宿主細(xì)胞被基因工程化以產(chǎn)生主要具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖選自Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂、Gal_（1-4）GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂和NANA_（1-4）Gal_（1-4）GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂。

13.權(quán)利要求6的方法，其中所述蛋白是人糖蛋白。

14.一種在酵母細(xì)胞中產(chǎn)生具有N-末端識(shí)別位點(diǎn)Xaa-Pro或Xaa-Ala的治療性蛋白的方法，其中Xaa代表任何一種氨基酸，所述方法包括：a.?用編碼具有選自Xaa-Pro和Xaa-Ala的N-末端識(shí)別位點(diǎn)的治療性蛋白的多核苷酸載體轉(zhuǎn)化其中DAP活性已經(jīng)被去除的基因修飾的酵母細(xì)胞；b.?在誘導(dǎo)治療性蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；以及c.?從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中分離治療性蛋白。