[發(fā)明專利]用于單分子全基因組分析的方法和相關(guān)裝置

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080056871.5
• 申請日: 2010-10-21
• 公開（公告）號: CN103502468A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖明;索梅斯庫瑪·達斯
• 申請（專利權(quán)）人: 生物納米基因公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219
• 代理人: 張穎;謝麗娜

與相關(guān)申請的交叉參考

本申請要求2009年10月21日提交的序號61/253,639的美國申請“用于單分子全基因組分析的方法和相關(guān)裝置（Methods?and?Devices?for?Single?Molecule?Whole?Genome?Analysis）”的優(yōu)先權(quán)，所述申請的全部內(nèi)容在此引為參考。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及納米技術(shù)領(lǐng)域和單分子基因組分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)

大分子例如DNA或RNA是由核苷酸組成的長聚合物鏈，其線性序列與源生物體的基因組和后基因組基因表達信息直接相關(guān)。

序列區(qū)、基序和功能單元例如開放閱讀框（ORF）、非翻譯區(qū)（UTR）、外顯子、內(nèi)含子、蛋白因子結(jié)合位點、表觀基因組位點例如CpG簇、microRNA位點、轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子以及其他結(jié)構(gòu)和功能單元的直接測序和作圖，在個體的基因組組成和“健康概況”的評估中是重要的。

在某些情況下，核苷酸序列的復(fù)雜重排，包括片段復(fù)制、插入、缺失、倒置和易位，在個體的生命期內(nèi)引起疾病狀態(tài)，包括遺傳畸變或細胞惡變。在其他情況下，序列差異、拷貝數(shù)變異（CNV）和不同個體的遺傳構(gòu)成之間的其他差異，反映出群體遺傳構(gòu)成的多樣性和對環(huán)境刺激物和其他外部影響例如藥物治療的差異響應(yīng)。

其他進行過程例如DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)折疊和改變DNA-DNA、DNA-RNA或DNA-蛋白質(zhì)相互作用的其他變化，影響基因調(diào)控、表達以及最終細胞功能，引起疾病和癌癥。

基因組結(jié)構(gòu)變異（SV）甚至在健康個體中也廣泛分布。理解基因組序列信息對人類健康的重要性，已變得越來越明顯。

常規(guī)細胞遺傳學(xué)方法例如核型分析、FISH（熒光原位雜交），提供了對少至單個細胞中基因組組成的全面觀察。這些方法揭示了基因組的總體變化，例如非整倍性、數(shù)千和數(shù)百萬堿基對的大片段的獲得、丟失或重排。然而，這些方法患于在檢測中到小序列基序或病變中靈敏度和分辨率相對低，以及繁瑣、速度有限和精確性不一致。

更近的用于檢測序列區(qū)、目標(biāo)序列基序和SV的方法例如aCGH（陣列比較基因組雜交）、fiberFISH或大規(guī)模末端配對測序，具有提高的分辨率和通量。這些更近的方法仍然是間接、繁瑣和不一致、昂貴的，并往往具有有限的固定分辨率，依賴于回到參比基因組進行作圖以重新裝配來提供推斷的位置信息，或提供不能揭示平衡病變事件例如倒置或易位的比較性強度比率信息。

據(jù)認(rèn)為，功能單元和常見結(jié)構(gòu)變異涵蓋從數(shù)十堿基至數(shù)兆堿基以上的范圍。因此，沿著大的天然基因組分子，跨越從不到千堿基（即長度小于約1千堿基）至數(shù)兆堿基的分辨率尺度揭示序列信息和SV的方法，在更多個體的測序和精細尺度作圖計劃中是非常合乎需要的，以便一覽以前未表征的基因組特征。

此外，生物系統(tǒng)、特別是多倍體生物例如人類的表型多態(tài)性或疾病狀態(tài)，是從母系和父系遺傳的兩個單倍體基因組之間相互作用的結(jié)果。癌癥常常是二倍體染色體病變中雜合性丟失的結(jié)果。

當(dāng)前的測序分析方法多半基于源自于具有有限單倍型信息的平均化多倍體基因組材料的樣品。這大多是由于目前使用的現(xiàn)有前端樣品制備方法從非均質(zhì)細胞群體提取混合二倍體基因組材料、然后將它們破碎成隨機的較小碎片所造成的。然而，這種方法破壞了二倍體基因組的天然結(jié)構(gòu)信息。

最近開發(fā)的第二代測序方法，盡管通量提高，但由于從短得多的測序讀出結(jié)果進行裝配更加困難，因此使勾勒復(fù)雜基因組信息進一步復(fù)雜化。

一般來說，短讀出結(jié)果更難在復(fù)雜基因組內(nèi)進行唯一比對，需要其他序列信息來破譯短的靶區(qū)的線性次序。需要25倍量級的測序覆蓋度才能達到在常規(guī)BAC和鳥槍法Sanger測序中需要8-10倍覆蓋率所達到的近似的裝配可信度（Wendl?MC,Wilson?RK，醫(yī)學(xué)DNA測序中的覆蓋度情況（Aspects?of?coverage?in?medical?DNA?sequencing），BMC?Bio?informatics?2008?May?16;9:239）。這對測序成本降低提出了進一步挑戰(zhàn)，并使將測序成本顯著降低至1000美元目標(biāo)標(biāo)桿以下的初始主要目標(biāo)受挫。

大的完整基因組分子的單分子水平分析，通過不使用克隆過程或擴增對序列基序進行原位精細作圖，提供了保留準(zhǔn)確的天然基因組結(jié)構(gòu)的可能性。基因組片段越大，基因組分析物中樣品群體的復(fù)雜性越低。在理想情形下，只需要對46個染色體片段進行單分子水平分析，就能覆蓋整個二倍體人類基因組；從這樣的方法得到的序列在其本質(zhì)上具有完整的單倍型信息。