[發明專利]核酸的等位基因特異性擴增

在審

• 申請號: 201080055770.6
• 申請日: 2010-12-10
• 公開（公告）號: CN102656278A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: A·贊;N·牛頓;S·G·威爾
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;郭文潔

1.一種靶序列變體的等位基因特異性擴增的方法，所述靶以幾個變體序列的形式存在，所述方法包括

（a）使第一種和第二種寡核苷酸與靶序列的至少一個變體雜交；其中第一種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且第二種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸第二種寡核苷酸，其中所述聚合酶能夠在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時優先延伸所述第二種寡核苷酸，并且在所述選擇性核苷酸不與靶形成堿基對時基本上更少。

2.權利要求1的方法，其中步驟（b）中的所述核酸聚合酶能夠在所述選擇性核苷酸與所述靶形成堿基對時唯一地延伸所述第二種寡核苷酸。

3.權利要求1的方法，其中所述選擇性核苷酸在接近所述寡核苷酸3'末端的1?–?5個核苷酸之間的位置上。

4.權利要求1的方法，其進一步包括檢測步驟（b）中的引物延伸產物的步驟（c）。

5.權利要求1或2的方法，其中所述核酸聚合酶選自Taq?DNA聚合酶、Z05?DNA聚合酶、ΔZ05?DNA聚合酶和ΔZ05-Gold?DNA聚合酶。

6.權利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶具有3’-5’核酸酶活性。

7.權利要求6的方法，其中所述核酸聚合酶選自Pfu?DNA聚合酶和海棲熱袍菌（Thermatoga?Maritima）。

8.權利要求1的方法，其中步驟（a）中的所述序列變體是人BRAF、EGFR、PIK3CA或KRAS基因的V600E突變。

9.權利要求1的方法，其中所述第一種寡核苷酸是SEQ?ID?NO：11。

10.權利要求1的方法，其中所述第二種寡核苷酸選自SEQ?ID?NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16和17。

11.一種檢測靶序列變體的方法，所述靶以幾個變體序列的形式存在，所述方法包括

（a）使第一種和第二種寡核苷酸與靶序列的至少一個變體雜交；其中所述第一種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且所述第二種寡核苷酸與靶序列的一個或多個變體至少部分互補，并且具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸；

（b）用核酸聚合酶延伸第二種寡核苷酸；其中所述聚合酶能夠在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時優先延伸所述第二種寡核苷酸，并且在所述選擇性核苷酸不與靶形成堿基對時基本上更少；和

（c）檢測所述寡核苷酸延伸的產物，其中延伸表示寡核苷酸對其具有互補選擇性核苷酸的靶序列變體的存在。

12.一種用于靶序列的等位基因特異性擴增的試劑盒，所述靶以幾個變體序列的形式存在，所述試劑盒包括：

（a）與靶序列的一個或多個變體至少部分互補的第一種寡核苷酸；和

（b）具有與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸、與靶序列的一個或多個變體至少部分互補的第二種寡核苷酸。

13.權利要求12的試劑盒，其進一步包括核酸聚合酶、三磷酸核苷、適合于通過所述核酸聚合酶的核酸延伸的緩沖液和用于執行等位基因特異性擴增的一組說明書。

14.一種用于執行靶序列的等位基因特異性擴增的寡核苷酸，所述靶以幾個變體序列的形式存在，所述寡核苷酸包括

（a）與所述靶序列的一個或多個變體的部分至少部分互補的序列；

（b）與靶序列的僅一個變體互補的至少一個內部選擇性核苷酸。

15.權利要求14的寡核苷酸，其進一步包括具有在環外氨基上共價修飾的堿基的至少一個核苷酸。

16.權利要求15的寡核苷酸，其中具有在環外氨基上共價修飾的堿基的一個核苷酸的結構選自：

其中S代表糖部分，并且R代表改性劑基團。

17.權利要求16的寡核苷酸，其中所述修飾的核苷酸在相對于3'末端的位置-5、-4、-3、-2或-1上出現。