[發明專利]在乳酸菌中改善流向乙酰乳酸來源產物的流量

在審

• 申請號: 201080053940.7
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN102712912A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: B·J·保羅;W·蘇
• 申請（專利權）人: 布特馬斯先進生物燃料有限責任公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N9/88;C12N1/21;C12N9/02;C12N9/10;C12N15/52;C12P7/16;C12N15/74
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;李炳愛

1.重組乳酸菌細胞，包含降低或消除內源性表達的乙酰乳酸脫羧酶的酶活性的至少一個工程化基因修飾和消除內源性表達的乳酸脫氫酶的酶活性的至少一個工程化基因修飾。

2.權利要求1的細菌細胞，包含消除內源性表達的乙酰乳酸脫羧酶的酶活性的至少一個工程化基因修飾和消除內源性表達的乳酸脫氫酶的酶活性的至少一個工程化基因修飾。

3.權利要求1的細菌細胞，其中每個工程化基因修飾是去除編碼乙酰乳酸脫羧酶或乳酸脫氫酶的基因的至少一部分。

4.權利要求3的細菌細胞，其中所述編碼乙酰乳酸脫羧酶的基因選自aldB、aldC和ald。

5.權利要求4的細菌細胞，其中所述編碼乙酰乳酸脫羧酶的基因編碼蛋白質，所述蛋白質具有的氨基酸序列與選自SEQ?ID?NO：24、26、28、30、32、34、36和38的序列具有至少約95％同一性。

6.權利要求3的細菌細胞，其中所述基因編碼乳酸脫氫酶并選自ldhL、ldhD、ldhL1和ldhL2。

7.權利要求6的細菌細胞，其中所述編碼乳酸脫氫酶的基因編碼蛋白質，所述蛋白質具有的氨基酸序列與選自SEQ?ID?NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22的序列具有至少約95％同一性。

8.權利要求1的細菌細胞，其中所述細胞是選自下組的屬的成員：乳球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、片球菌屬和鏈球菌屬。

9.權利要求1的細菌細胞，還包含降低丙酮酸甲酸裂解酶活性的至少一個基因修飾。

10.權利要求9的細菌細胞，其中所述基因修飾在編碼丙酮酸甲酸裂解酶的基因中、在編碼丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的基因中、或在上述兩種基因中。

11.權利要求10的細菌細胞，其中所述編碼丙酮酸甲酸裂解酶的基因選自pfl、pflB1和pflB2，并且所述編碼甲酸C-乙酰轉移酶激活酶的基因選自pflA、pflA1和pflA2。

12.權利要求1、2或8的細菌細胞，其中所述細胞產生異丁醇。

13.權利要求12的細菌細胞，包含異丁醇生物合成途徑。

14.權利要求13的細菌細胞，其中所述異丁醇生物合成途徑包括由下列組成的底物至產物的轉化：

a)丙酮酸至乙酰乳酸；

b)乙酰乳酸至2，3-二羥基異戊酸；

c)2，3-二羥基異戊酸至α-酮異戊酸；

d)α-酮異戊酸至異丁醛；以及

e)異丁醛至異丁醇。

15.制備重組乳酸菌細胞的方法，包括：

a)提供乳酸菌細胞；

b)通過基因工程來修飾(a)的細胞中編碼乳酸脫氫酶的至少一個內源性基因以消除內源性表達的乳酸脫氫酶的酶活性；

c)在(b)的細胞中從質粒表達乙酰乳酸脫羧酶活性以產生具有非染色體表達的乙酰乳酸脫羧酶的細胞；

(d)通過基因工程來修飾(c)的細胞中編碼乙酰乳酸脫羧酶的內源性基因以消除內源性表達的乙酰乳酸脫羧酶的酶活性；以及

(e)從(d)的細胞去除表達乙酰乳酸脫羧酶活性的所述質粒；

從而制備缺失內源性表達的乳酸脫氫酶和乙酰乳酸脫羧酶的酶活性的重組乳酸菌細胞。

16.制備重組乳酸菌細胞的方法，包括：

a)提供乳酸菌細胞；

b)通過基因工程來修飾(c)的細胞中編碼乙酰乳酸脫羧酶的內源性基因以消除內源性表達的乙酰乳酸脫羧酶的酶活性；

c)在(b)的細胞中從質粒表達乳酸脫氫酶活性以產生具有非染色體表達的乳酸脫氫酶的細胞；

(d)通過基因工程來修飾(a)的細胞中編碼乳酸脫氫酶的至少一個內源性基因以消除內源性表達的乳酸脫氫酶的酶活性；以及

(e)從(d)的細胞去除表達乳酸脫氫酶活性的所述質粒；

從而制備缺失內源性表達的乳酸脫氫酶和乙酰乳酸脫羧酶的酶活性的重組乳酸菌細胞。

17.權利要求15的方法，其中步驟(b)包括在(c)之前修飾編碼乳酸脫氫酶的第一基因，然后在步驟(c)之后通過基因工程來修飾編碼乳酸脫氫酶的第二基因。