[發(fā)明專利]用于制備多肽的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080053592.3
• 申請(qǐng)日: 2010-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN102639559A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A.S.安德森;I.勞特魯普-拉森;P.諾爾加爾德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 諾沃—諾迪斯克有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/47
• 分類號(hào): C07K14/47;C12N15/81;C12N9/48;C12P21/06;C12N9/60;C12P21/02
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 孔青;林森

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于在基因修飾的酵母菌株中制備多肽的方法。

發(fā)明背景

用適宜的包含編碼異源蛋白的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后在酵母中表達(dá)所述蛋白已經(jīng)成功地用于多種多肽，例如胰島素前體、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽和它們的功能類似物。

然而，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物是各種期望的具有不同的氨基酸鏈長度的多肽前體的異質(zhì)混合物。這是因?yàn)榻湍府a(chǎn)生大量負(fù)責(zé)加工較大的前體分子以釋放成熟多肽的蛋白水解酶。包括PEP4和KEX1基因產(chǎn)物在內(nèi)的大量蛋白酶負(fù)責(zé)這樣的酵母蛋白降解。

使用KEX1破壞株用于重組體蛋白的表達(dá)早先已有描述。因此，EP341215和US?6,103,515描述使用缺乏KEX1的酵母菌株用于產(chǎn)生不帶堿性C-末端氨基酸的肽，例如hANP、EGF、結(jié)締組織活化肽-III、水蛭素和水蛭素變體。

大半已知的神經(jīng)肽和內(nèi)分泌肽是α-酰胺化的，且在大多數(shù)情況下，此結(jié)構(gòu)特征對(duì)受體識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和因此對(duì)生物學(xué)功能是必不可少的。α-酰胺化源自于C-末端甘氨酸，其被酶促轉(zhuǎn)變?yōu)轷０贰?/p>

如果細(xì)胞具有用于體內(nèi)α-酰胺化的必要機(jī)器(machinery)，那么可直接在生產(chǎn)細(xì)胞中生產(chǎn)α-酰胺化肽。然而，包括酵母在內(nèi)的一些有機(jī)體不能產(chǎn)生α-酰胺化，因?yàn)樗鼈儾槐磉_(dá)用于體內(nèi)α-酰胺化的必要酶，因此通過細(xì)胞生產(chǎn)的肽不得不通過隨后的體外步驟α-酰胺化。

如果酵母被用作重組體生產(chǎn)細(xì)胞，一個(gè)解決方案是生產(chǎn)帶有C-末端甘氨酸的前體多肽，然后在隨后的體外過程中用α-酰胺化酶將其轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酰胺化肽(D.?J.?Merkler?(1994).?C-Terminal?amidated?peptides:?Production?by?the?in?vitro?enzymatic?amidation?of?glycine?extended?peptides?and?the?importance?of?the?amide?to?bioactivity?(C-末端酰胺化肽：通過甘氨酸延伸肽的體外酶促酰胺化進(jìn)行生產(chǎn)和酰胺對(duì)生物活性的重要性).?Enzyme?Microb.?Technol.:?16(450-456)。

然而，意想不到地，本發(fā)明的發(fā)明人等已發(fā)現(xiàn)C-末端甘氨酸被從釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)表達(dá)的大量肽中切除，使得隨后轉(zhuǎn)化為α-酰胺化肽不可能。

本發(fā)明通過使用不切除C-末端甘氨酸殘基的基因修飾的酵母菌株提供一種針對(duì)該問題的解決方案。

發(fā)明概述

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種在酵母中制備帶有C-末端Gly的多肽的方法，其中酵母菌株具有非功能性KEX1基因。

可通過使用熟知的技術(shù)使KEX1基因無功能。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中簡單地缺失KEX1基因，而在另一個(gè)實(shí)施方案中通過位點(diǎn)特異突變(例如通過同源重組)使KEX1基因無功能。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種在具有非功能性KEX1基因的酵母菌株中制備多肽的方法，其中所述多肽具有甘氨酸作為其C-末端氨基酸殘基，且其中所述方法包括以下步驟：

a)?將包含編碼多肽的DNA序列的酵母菌株在用于在酵母菌株中表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)，和

b)?分離表達(dá)的多肽。

表達(dá)的多肽可從細(xì)胞培養(yǎng)物或從酵母細(xì)胞中分離，這取決于表達(dá)的多肽是否從酵母細(xì)胞中分泌。

如果C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸是以下氨基酸殘基之一，那么C-末端甘氨酸特別不穩(wěn)定：Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile和Arg。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸為Tyr、Phe、Met、Leu、Trp、Ala、Ile或Arg。

“C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸”意指與C-末端氨基酸殘基(在該情形中是甘氨酸殘基)的N-末端連接的氨基酸殘基。

特別地，當(dāng)C-末端倒數(shù)第二個(gè)氨基酸是疏水氨基酸殘基且特別是芳族氨基酸殘基時(shí)，C-末端甘氨酸更不穩(wěn)定。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly鄰接的氨基酸殘基是Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile或Met，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Val、Leu、Ile或Met，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，與C-末端Gly連接的氨基酸殘基是Tyr、Phe或Trp。