[發(fā)明專利]堿性肽的檢測方法及堿性肽檢測用試劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080053485.0
• 申請日: 2010-12-10
• 公開（公告）號: CN102667487A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 加煙博幸;高橋英樹;丸山征郎;鶴岡禮奈
• 申請（專利權(quán)）人: 希森美康株式會社;國立大學(xué)法人鹿兒島大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/82;G01N33/52;G01N33/536;C07K14/47
• 代理公司: 北京市安倫律師事務(wù)所 11339
• 代理人: 張小英

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種堿性肽的檢測方法。更詳細地，本發(fā)明涉及的方法如下：將疑似含有堿性肽的試樣和含有變性的白蛋白的試劑混合，檢測出因堿性肽與變性的白蛋白的復(fù)合物而產(chǎn)生的渾濁，以此檢測出堿性肽。此外，本發(fā)明還涉及一種用于該檢測方法的堿性肽檢測用試劑。

背景技術(shù)：

人們已知，在患有特定病的生物中，特定的堿性肽的血中濃度與健康時不同。這種堿性肽如有生長素釋放肽（ghrelin）、腦尿鈉肽（BNP）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、心房利鈉肽（ANP）、以及緩激肽等，在臨床檢查領(lǐng)域，這些堿性肽被視為疾病的標(biāo)志物。比如，已知在患有重癥心力衰竭的患者、以及患有嚴(yán)重胃癌的患者中，作為堿性肽之一的生長素釋放肽在血漿中的濃度下降。此外，BNP的血中濃度是心力衰竭的重要臨床指標(biāo)，BNP也被用作檢查標(biāo)志物。

現(xiàn)在都是用酶免疫分析法、電化學(xué)發(fā)光免疫測定法等免疫學(xué)方法測定這些堿性肽。在這種免疫學(xué)方法當(dāng)中，使用特異性地識別上述堿性肽并與其結(jié)合的抗體進行測定。用此方法，要檢測出抗體與堿性肽的復(fù)合物，需要進行使標(biāo)記物與該復(fù)合物結(jié)合的步驟，因此操作繁瑣。

另一方面，Dennis和Lowenthal等人公開了一種堿性肽的檢測方法，與免疫測定法不同，該方法可以省略標(biāo)記物結(jié)合步驟。然而，該方法需要高價的、大型的質(zhì)量分析儀、表面等離子體共振分析儀等，因此很難說是一種能夠通用普及的方法。

此外，Dennis和Lowenthal等人為了發(fā)現(xiàn)病情指標(biāo)、探明藥理作用、以及開發(fā)藥物傳輸系統(tǒng)等，還對天然存在的白蛋白（未變性的白蛋白）與堿性肽之間的結(jié)合進行了研究。

所謂白蛋白是指蛋清、血清或乳汁等物質(zhì)中天然含有的蛋白質(zhì)。以血清白蛋白為例，已知其生理機能是調(diào)節(jié)血液的滲透壓，與脂肪酸、血素色、膽紅素等血液中的代謝產(chǎn)物、藥劑等化合物、以及特殊肽等結(jié)合，并在血液中循環(huán)。

比如Baczynskyj等人暗示了已知的血中荷爾蒙，即緩激肽與BSA?(牛血清白蛋白)結(jié)合的可能性。Muramoto等人報告稱，血中肽激素ACTH會與牛血清白蛋白（BSA）結(jié)合。

在先技術(shù)文獻

非專利文獻

非專利文獻1：Muramoto?K.等，《生物化學(xué)》（Biochemistry）,?vol.?20，3380-3385（1981）

非專利文獻2：Baczynskyj?L.等，《質(zhì)譜快報》（Rapid?Commun.?Mass?Spectrom.）,?vol.?8，280-286（1994）

非專利文獻3：Dennis?MS等，《生物化學(xué)期刊》（J.?Biol.?Chem.）,?vol.?277，35035-35043（2002）

非專利文獻4：Lowenthal?MS等，《臨床化學(xué)》（Clin.?Chem.）,?vol.?51，1933-1945?(2005)。

?

發(fā)明內(nèi)容：

發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明人從熱力學(xué)平衡理論的角度出發(fā)，對堿性肽和未變性白蛋白的結(jié)合、特別是二者通過結(jié)合相互造成的分子結(jié)構(gòu)變化的機制進行了研究。在此，所謂熱力學(xué)平衡理論是指：用表示結(jié)合強弱（親和性）的解離常數(shù)（Kd值）、以及反映結(jié)合所伴隨的別構(gòu)性結(jié)構(gòu)變化的協(xié)同性（希爾系數(shù)）這些明確的數(shù)值，描述溶液中實際發(fā)生的分子間結(jié)合。

在這一研究過程中，本發(fā)明人承認(rèn)，如上述Lowenthal等人的報告所記載的，堿性肽會和未變性白蛋白結(jié)合。Lowenthal等人的檢測方法是依賴于質(zhì)量分析儀的機械物理學(xué)方法。在該檢測方法中，先將堿性肽和未變性白蛋白的混合物固定在質(zhì)量分析儀的試樣固定用高分子基板上，然后將其展開。即，在該檢測方法中，堿性肽和未變性白蛋白兩者均處于脫離實際的溶液平衡的狀態(tài)下，僅有一部分分子團可以被檢測出。

相對而言，本發(fā)明人則是將堿性肽和未變性白蛋白始終靜置于溶液中，并對他們自身的自然結(jié)合，即實際的溶液平衡進行追蹤。與上述在先技術(shù)不同，本發(fā)明人探討的方法是利用此溶液平衡，檢測出堿性肽、或堿性肽與未變性白蛋白的復(fù)合物。

然而，在上述探討過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在先技術(shù)中未報告的現(xiàn)象，即堿性肽與未變性白蛋白的結(jié)合的親和性很弱。因此，在此檢測方法中，其檢測靈敏度無法令人滿意。

因此，要檢測出上述復(fù)合物，需要另行使用標(biāo)記物檢測步驟，或是想辦法促進上述溶液平衡中的結(jié)合親和性。