[發明專利]人類人工染色體載體

無效

• 申請號: 201080052081.X
• 申請日: 2010-11-17
• 公開（公告）號: CN102803488A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 黑巖義巳;松下裕昭;佐野曉子
• 申請（專利權）人: 協和發酵麒麟株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;A01K67/027;C07K16/00
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

技術領域

本發明涉及一種人類人工染色體載體，其包含人類抗體重鏈基因、人類抗體輕鏈基因和人類抗體替代輕鏈基因，還涉及具有所述人類人工染色體載體的動物以及生產人類抗體的方法。

背景技術

通過將包含人類染色體片段的微核與具有多能分化性的細胞進行融合以獲得雜交細胞來產生嵌合動物的技術開發，允許制備保持了待生產的大外源基因的非人類動物（非專利文獻1和專利文獻1）。

隨后，提出了構建所需人類人工染色體（在后文中縮寫為HAC）載體以生產非人類動物的方法，通過該方法已建立了包含廣泛的各種人類抗體基因座的HAC。

首先，作為對將要引入到非人類動物中的染色體片段進行修飾的方法，已經開發了通過基因打靶將端粒序列插入到保持在雞DT40細胞中的人類染色體上的目標序列中，以高效制備缺失染色體的技術（專利文獻2）。

此外，在保持有人類染色體的小鼠細胞的維持過程中，已發現可以獲得包含源自于人類14號染色體的抗體重鏈基因座的片段SC20，并且所述片段穩定地維持在胚胎干（ES）細胞和小鼠個體中，并且向后代傳遞的效率高（專利文獻2）。

因此，使用例如SC20作為載體的基本骨架，通過Cre/loxP位點特異性重組系統對包含人類22號染色體上的抗體λ型輕鏈基因座的片段進行易位，構建了包含人類抗體重鏈和人類λ鏈的λHAC（非專利文獻2和專利文獻3）。

λHAC具有與SC20幾乎等同的穩定性和后代傳遞效率，并且通過將該λHAC導入小鼠ES細胞產生了穩定維持λHAC的嵌合小鼠（非專利文獻2和專利文獻3）。通過這種方法，現在能夠構建包含具有特定的兆堿基（Mb）尺寸的人類染色體區的HAC載體。

此外，出于移除對染色體導入動物的產生具有不利影響的染色體區的目的，根據人類22號染色體的結構信息（非專利文獻3），制備了具有優化尺寸并包含抗體λ型輕鏈（λ鏈）基因區的染色體片段ΔHAC和ΔΔHAC（專利文獻4）。

已證實，ΔHAC和ΔΔHAC分別包括具有2.5Mb和1.5Mb大小的區域，這些區域比λHAC上抗體λ型輕鏈基因區周邊10Mb短，提供了比λHAC更高的后代傳遞效率（專利文獻4）。

同時，從獲自多個人類供體的血清合并物制備了目前用于治療和預防各種疾病的人類多克隆抗體。因此，人類多克隆抗體的性能很大程度上取決于作為供應源的人類供體血清，因此在制備中需要選擇具有所需抗原反應性或滴度的供體的過程。

此外，由于多克隆抗體制備中的多種因素例如抗原種類、暴露于免疫原的次數以及可以收集的供體血清的量，其應用的發展受到限制。因此，已制備了具有人類抗體基因座的轉基因動物作為用于生產人類多克隆抗體的工具。

由于體型，有蹄類動物可用作大量人類多克隆抗體的供應源。到目前為止，為了生產人類多克隆抗體，導入了上述HAC、特別是ΔHAC和ΔΔHAC以生產人類多克隆抗體的牛，是已知的（非專利文獻4和專利文獻5）。

在導入了這些HAC的牛的新生仔血清中，產生了13至258ng/mL的人類免疫球蛋白（Ig）G（非專利文獻4）。

隨后，為了消除在牛活體中產生的牛抗體，在編碼牛內源抗體重鏈基因中的功能性IgM基因的IGHM和IGHML1上執行了基因打靶，作為結果，其中抗體重鏈被敲除的牛是已知的（非專利文獻5和6以及專利文獻6和7）。

當將ΔΔHAC導入獲得的抗體重鏈雙敲除牛（IgHM^-/-/IgHML1^-/-牛）中時，發現在14日齡小牛的血清中產生了7.1μg/mL人類IgG（專利文獻7）。

此外，產生了其中導入κHAC的牛，所述κHAC是具有人類抗體重鏈基因座和人類抗體κ型輕鏈（κ鏈）基因座的HAC載體（非專利文獻6和專利文獻8）。κHAC是通過將包含人類2號染色體上的抗體κ鏈基因座的片段易位到SC20上而構建的載體。在圖1中顯示了κHAC的示意圖。

在導入了κHAC的IgHM^-/-/IgHML1^-/-牛中，克隆468是抗體生產最高的個體，從出生后84天起，在血清中恒定地產生1g/L以上的人類IgG，并且在出生后210天顯示出超過2g/L的滴度。

然而，穩定地產生表現出如上所述的高滴度的個體的技術還是未知的，因此對于以較高效率生產人類抗體的動物或能夠穩定地產生這些動物的技術，存在著需求。

現有技術文獻

專利文獻