[發明專利]使用雙鏈核酸復合物與耐熱聚合酶用于合成脫氧核糖核苷酸鏈的組合物和方法

無效

• 申請號: 201080050355.1
• 申請日: 2010-11-05
• 公開（公告）號: CN102791877A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 斯蒂芬·皮科內;克里斯托弗·伯努瓦;比利亞納·科萊瓦
• 申請（專利權）人: 酶學有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 李丙林;張英

相關申請

本申請要求由Stephen?Picone等人在2009年11月6日提交的題為“使用雙鏈核酸復合物與耐熱聚合酶用于合成脫氧核糖核苷酸鏈的組合物和方法”的美國臨時申請號61/258,684的優先權。

將上述申請的全部教導以引用方式并入本文。

背景技術

DNA聚合酶為催化脫氧核糖核苷酸聚合為核酸鏈的酶。在多種DNA技術中使用聚合酶，包括PCR擴增，即復制或擴增DNA鏈的過程。一些PCR方法的重要問題是非特異性擴增產物的產生（例如，產生不想要的DNA鏈）。在許多情況下，這是由于非特異性寡核苷酸引發和副反應的非靶寡核苷酸的產生，如背景DNA的錯誤引發和/或在實際的熱循環過程自身之前引物的低聚化以及隨后的引物延伸事件。由于耐熱DNA聚合酶在環境溫度下具有適當的活性，這經常發生。

為了使該問題減少至最低程度，可進行稱為“熱啟動”PCR的方法。在熱啟動PCR中，將擴增反應所需的一種成分從反應混合物中分離或使其保持非活性狀態，直到首次將反應混合物的溫度升高。由于聚合酶在這些條件下不能發揮作用，因此在引物能夠非特異性結合的時期引物延伸較少。為了達到該效果，已經采用了幾種方法：DNA聚合酶的物理分離（例如，使用固體蠟屏障以將DNA聚合酶與反應混合物分離），DNA聚合酶的化學修飾（例如，使DNA聚合酶可逆地失活），聚合酶DNA抗體（polymerase?DNA?antibody）（例如，在室溫環境下結合并在擴增過程中在較高溫度下分離的抗體），通過核酸添加物的DNA聚合酶抑制，適體（例如，可充當抗體的形成環、假結體、和復雜三級結構的核苷酸的單鏈形式），阻斷引物等。這些方法中的多種不方便或運行不能達到使非特異性擴增最小化的所需效果。

因此，需要存在獨特且可替換的組合物和方法用于擴增反應，其不僅在擴增過程自身之前，而且在熱循環過程期間可提供非特異性引發和引物延伸的抑制。更具體而言，需要存在可替換和改進的組合物及方法用于熱啟動PCR。

發明內容

本發明涉及用于核酸擴增的阻斷雙鏈核酸復合物（DSC）。在一個實施方式中，復合物包括分離的雙鏈核酸分子，所述分離的雙鏈核酸分子包括具有包括約9至約40個之間核酸堿基的第一序列的第一核酸鏈；以及具有包括與第一序列互補的約9至約40個之間核酸堿基的第二序列的第二核酸鏈（核酸第二鏈），其中所述第一核酸鏈和第二核酸鏈各自具有3’端和5’端，并且其中雙鏈核酸分子具有在約50%至約70%之間范圍內的胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）的百分比。雙鏈核酸復合物也包括阻斷分子，其中所述阻斷分子共價結合于第一核酸鏈、第二核酸鏈、或兩者的3’端或5’端。在一個方面，雙鏈核酸分子（例如DNA或RNA）具有在約25°C至約90°C之間范圍內的解鏈溫度。在一個實施方式中，本發明的DSC進一步包括尿嘧啶堿基的引入。當使用來自古細菌種的DNA聚合酶時，向DSC中加入一個或多個尿嘧啶堿基可進一步降低室溫下的聚合酶活性。特別地，DSC的第一序列或第二序列進一步包括一個或多個尿嘧啶堿基。

阻斷分子的實例包括脫氧胸苷、雙脫氧核苷酸、3’磷酸化（3’phosphorylation）、己二醇、間隔分子、1’2’-雙脫氧核糖、2’-O-甲基RNA、和/或鎖核酸（LNA）。在一個實施方式中，阻斷分子具有以下結構：

反向dT。

本發明還涉及用于核酸擴增的阻斷雙鏈核酸復合物；其中所述復合物包括分離的雙鏈核酸分子，所述分離的雙鏈核酸分子包括具有包括約9至約40個之間核酸堿基的第一序列的第一核酸鏈，以及具有包括與第一序列互補的約9至約40個之間核酸堿基的第二序列的第二核酸鏈，其中所述第一核酸鏈和第二核酸鏈各自具有3’端和5’端，并且雙鏈核酸分子具有在約25°C至約90°C之間范圍內的解鏈溫度。該實施方式包括阻斷分子，所述阻斷分子共價結合于第一核酸鏈、第二核酸鏈、或兩者的3’端或5’端。在一個方面，第一序列或第二序列進一步包括一個或多個尿嘧啶堿基。