[發明專利]5.9kDa肽的免疫學測定方法

有效

• 申請號: 201080048601.X
• 申請日: 2010-10-13
• 公開（公告）號: CN102597772A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 菊地涉;佐藤百惠;野田健太;清川嚴;三浦俊英;小島良;野村文夫;曾川一幸
• 申請（專利權）人: 日東紡績株式會社
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C07K16/18
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

【技術領域】

本發明涉及用于從待測樣品檢測通過蛋白質組解析發現可作為肝臟疾病用肽標記物利用的，人纖維蛋白原α-E鏈、或者，是人纖維蛋白原α鏈的分解產物，有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(以下，稱之為5.9kDa肽)、或者，定量待測樣品中的5.9kDa肽濃度的免疫學測定方法、及，免疫學測定用試劑盒。另外，本發明涉及5.9kDa肽的免疫學測定方法中使用的，識別5.9kDa肽的N末端區域的抗體及識別C末端區域的抗體。

【背景技術】

近年，在世界規模進行一并的蛋白質組解析，也廣泛進行使用蛋白質組解析的疾病標記物的探索(專利文獻1～2、非專利文獻1～3)。在蛋白質組解析中，一般而言，各自分離作為活體來源樣品中包含的蛋白質或其分解產物的肽，用質譜分析裝置解析分離的蛋白質或肽的氨基酸序列，核對得到的氨基酸序列和數據庫中的氨基酸序列，由此鑒定樣品中包含的蛋白質或肽。由于根據疾病的有無而在活體內表達的蛋白質不同，通過蛋白質組解析而有可將發現疾病特異性地表達量增減的蛋白質或肽作為其疾病標記物利用的可能性。

通過蛋白質組解析，本發明人從在以戒酒目的住院的酒精依賴癥患者中經時采集的血清待測樣品，作為伴隨習慣飲酒而增減的新穎的血清肽之一鑒定了5.9kDa肽，發現可將這作為肝臟疾病診斷標記物利用(專利文獻1、非專利文獻1-2)。

另外，本發明人發現，使用由54個殘基組成的5.9kDa肽的全長肽作為抗原而得到的兩種類的單克隆抗體，使單離的5.9kDa肽的免疫學測定成為可能(專利文獻1)。

【現有技術文獻】

【專利文獻】

專利文獻1：國際公開第2004/058966號

專利文獻2：國際公開第2004/090550號

【非專利文獻】

非專利文獻1：Nomura，F.et?al.，Proteomics，4，1187-1194，2004

非專利文獻2：Nomura，F.et?al.，J.Chromatogr.B.，855，35-41，2007

非專利文獻3：Hanash，S.M.et?al.，Nature，452，571-579，2008

【發明內容】

【發明要解決的技術課題】

至今，使用蛋白質組解析報告了幾種臨床上有用的肽。但是，在本發明人所知的范圍內幾乎未見到使用在臨床診斷的領域廣泛一般地使用的免疫學的檢測方法而定量測定這些的疾病標記物候選肽的報告。此免疫學測定方法的確立困難的點妨礙通過蛋白質組解析發現的肽標記物的普及。

作為免疫學測定方法的確立困難的原因，第一，可舉出對肽的特異性抗體的制備困難。第二，可舉出通過蛋白質組解析發現的肽也多為活體來源樣品中存在的成熟的蛋白質的分解產物，包含作為目的的肽的序列的目的肽以外的多種分解產物混在于樣品中。這時，即便將作為目的的肽作為免疫原制出抗體，也發生與混在的分解產物的非特異性的反應，無法正確地定量分析目的肽。

特別是，通過分解作為本發明的測定對象的5.9kDa肽而產生的人纖維蛋白原是與凝固-纖溶系統無關的蛋白質，活體內大量存在其分解物。具體而言，纖維蛋白原在凝固系統中被凝血酶分解而產生纖維蛋白單體。在纖溶系統中，由于由纖維蛋白單體構成的纖維蛋白聚合物由纖溶酶在多個部位被分解，必然產生多個纖維蛋白原分解產物。

例如，根據數據庫PeptideAtlas(http://www.peptideatlas.org/)中的build?Human?Plasma?PeptideAtlas?2009-05，作為人纖維蛋白原α-E鏈(數據庫內蛋白質名：ENSP00000306361)的分解產物觀測到239種的肽。

如前所述，本發明人成功進行了，對將由54個殘基組成的5.9kDa肽的全長肽作為抗原的5.9kDa肽的兩種類的單克隆抗體的制成、及，單離的5.9kDa肽的免疫學測定(專利文獻1)。但是，即便使用這些單克隆抗體，在充分地正確地測定有包含多個人纖維蛋白原分解產物的可能性的待測樣品中的5.9kDa肽的定量中也有再改良的余地。

鑒于此實狀，本發明的課題在于提供從有包含多個人纖維蛋白原α-E鏈/α鏈分解產物的可能性的待測樣品特異性地檢測5.9kDa肽而定量的免疫學測定方法。而且，本發明的課題旨在提供用于在該免疫學測定方法中使用的試劑盒以及該免疫學測定方法及該試劑盒中使用的識別5.9kDa肽的N末端區域的抗體及識別C末端區域的抗體。

【解決課題的技術方案】