[發明專利]新的流感病毒

無效

• 申請號: 201080042340.0
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN102648000A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: T.馬斯特;E.羅馬諾夫斯卡亞-羅曼科;O.基塞萊夫;M.沃爾斯切克;B.弗科;A.艾戈洛夫
• 申請（專利權）人: 阿維爾綠山生物技術研究發展貿易股份公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;C12N7/04
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 閔丹

本發明提供了新的流感病毒，所述病毒中NS和PB1基因節段均經過改造，并且PB1-F2?ORF被導入了至少一個終止密碼子。根據特定實施方案，所述流感病毒缺少功能性NS1和PB1-F2蛋白，在干擾素活性細胞(interferon?competent?cells)中是復制缺陷的。

此外，提供了包含所述改造的流感病毒的疫苗制劑及其預防流感感染的用途。

發明背景

A型流感病毒是威脅人和動物的最常見病原體之一，甚至可能引起災難性的大流行。A型流感病毒每年在世界范圍內造成300,000-500,000例死亡，在大流行的年份中，這個數字可能增加到1百萬(1957-1958年)或者可能象1918-1919年發生的情況，高達5千萬。近年，關于高致病性的禽流感病毒(H5N1)造成大流行的可能性已引起人們的極大關注。1997年香港發生了人體H5N1感染的一次小規模爆發，造成18人被感染和6例死亡，至今共計383例人感染事件，而死亡率達到61％。

已在歐洲獲得批準的滅活流感疫苗僅有有限的保護效果，特別是對于老年群體和還未經歷過天然流感的幼童來說。冷適應活流感疫苗能夠更有效地用于兒童的疾病預防和控制疾病傳播，但當前可以利用諸如反向遺傳學的新技術來進一步改善活疫苗方法。

目前的減毒活疫苗的概念基于產生適應在25℃生長(冷適應)的溫度敏感的、減毒的“主毒株(master?strain)”。冷適應活病毒疫苗和滅活病毒疫苗以不同方式刺激免疫系統，但這兩種情況中，缺乏足夠的免疫原性是流感疫苗接種的最重要的缺點之一，尤其是對于老年人。

盡管ca活流感病毒疫苗被認為是足夠安全的，減毒的確切遺傳和分子機制并未被徹底理解。冷適應流感疫苗的安全屬性據稱是基于散布在內部基因區段上的大量點突變之上的。但只有少數通過作圖定位到聚合酶基因內的突變可以造成那些不能在正常體溫復制的冷適應病毒株的弱化(Herlocher，M.L.，A.C.Clavo，and?H.F.Maassab.1996，Virus?Res.42：11-25；Herlocher，M.L.，H.F.et?al.，1993，Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A.90：6032-6036)。事實上，活疫苗株的遺傳穩定性受到了諸多質疑，因為從接種了疫苗的宿主體內重新分離得到的病毒顯示出額外的點突變，而這些點突變可能最終發揮出“抑制”突變的作用，造成回復病毒的復制性能加強并可能喪失溫度敏感的表現型(Herlocher，M.L.，H.F.et?al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90：6032-6036，Treanor，J.，M.et?al.，1994?J?Virol.68：7684-7688.)。

對流感遺傳學的新認識給構建用于活疫苗的理想免疫株提供了指導，其中可能通過靶向遺傳工程將全部的主要致病因子去除。A型流感病毒含有分節段的負鏈RNA基因組(Lamb?&?Krug，1996)。8個節段編碼轉錄酶復合體(PB1、PB2、PA、核蛋白NP)、三個整合膜蛋白(凝血素HA、神經氨酸苷酶NA、蛋白通道M2)、基質蛋白(M1)、核輸出蛋白(NS2/NEP)和非結構性多功能致病因子NS1的亞基。

已證實，顯示缺失NS1蛋白，由于在干擾素感受態(interferon?competent)細胞或生物體中不能復制(復制缺陷表現型)會導致流感病毒的毒力明顯減弱。缺少NS1蛋白的病毒不能拮抗被感染的細胞產生的細胞因子，因此誘發自體佐劑化(self-adjuvanting)和免疫調節效應。用DelNS1病毒進行免疫后的免疫反應特征是引發與優勢IgG2A同種型抗體反應相關的Th1型免疫反應(B.Ferko?et?al.2002)。

據報道存在由節段2的替代ORF編碼的第11個蛋白(Chen?et?al.，2001)。這個促細胞凋亡蛋白能夠與線粒體蛋白ANT3(腺嘌呤核苷酸轉運蛋白3)和VDAC1(電壓依賴性陰離子通道1)相互作用，被認為是重要的致病因子。在被感染的宿主免疫細胞中觀察到了PB1-F2誘發的細胞類型依賴性細胞死亡，而表皮細胞中未見到這一現象。有可能病毒致病性的提高是由于被感染免疫細胞的凋亡造成了免疫反應的延遲。據估計在病毒復制的初期，PB1-F2的功能損害了諸如巨噬細胞和樹突細胞的專職抗原遞呈細胞遞呈抗原的能力。