[發明專利]使用大顆粒標記的高靈敏性免疫測定

有效

• 申請號: 201080040907.0
• 申請日: 2010-09-07
• 公開（公告）號: CN102549429A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: W·U·迪特默;T·H·埃弗斯;M·H·黑夫蒂;D·W·C·德克斯;M·F·W·C·馬滕斯
• 申請（專利權）人: 皇家飛利浦電子股份有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 林曉紅

技術領域

本發明涉及使用一種大顆粒標記的高靈敏性免疫測定。

背景技術

免疫測定廣泛用于健康護理和其他領域以確定諸如蛋白、激素、DNA、RNA或酶的特定分子的存在與否。

一種用于測定體液中的特異性靶標(抗原)濃度的公知方法是所謂的“酶聯免疫測定”(ELISA)。其中將來自樣品的分析物固定于固體支持物上，然后向該固體支持物加入特異于所述分析物的抗體，從而其可以結合所述分析物。所述抗體連接至酶。然后向所述固體支持物加入可以被酶轉化以產生諸如熒光團的可檢測部分的基底。洗滌步驟后，固體基底經過使得可以對可檢測部分進行檢測的處理，例如在熒光讀取器上進行處理。由此，這可以確定所述樣品中是否存在所述分析物。

夾心免疫測定包括兩種抗體，其結合抗原上不同且不重疊的表位。第一抗體(捕獲抗體)接合至固體支持物，然后加入包含抗原的樣品以允許形成抗原與捕獲抗體之間的復合物。通過洗滌步驟除去未結合的分子，然后加入標記的第二抗體(檢測抗體)，并允許其結合抗原與捕獲抗體的復合物，由此形成“夾心”。進行洗滌步驟以除去未結合的檢測抗體之后，通過測量標記的檢測抗體的量來測定靶分子的量。使用許多標記技術，包括熒光、化學發光、放射性或磁性標記。

在大部分情況下，使用識別靶標的不同位點的兩種單克隆抗體。在另一變體中，使用單克隆捕獲抗體和針對抗原上不同表位的親和力純化的多克隆檢測抗體。

在健康護理中，測量許多不同分子以診斷或監測疾病。例如，測量血糖含量以監測糖尿病。葡萄糖是以較高濃度存在于血液中的分子，其濃度為每mL約幾百μg至約1mg，對應于每mL約3至6毫摩爾的濃度。測量裝置以手持裝置的形式提供，包括測試帶。

相比之下，其他分子，如用于監測心力衰竭的生物標記NT-proBNP則以明顯較低的濃度存在于血液中。在健康個體中，NT-proBNP在血液中的濃度為約20pg-150pg/mL，對應于約24-176皮摩爾/mL。高于500pg/mL的值通常視為是急性充血性心力衰竭(CHF)的指征。

目前，測量極低濃度的生物標記以診斷疾病(例如心血管疾病)要求實驗室分析、大樣品體積以及15分鐘至數小時的時間結果(time-to-result)延滯。盡管這些測試是小型臺面測試，但是較長的運行時間和大樣品體積使得它們不適合于更高要求的情況，例如醫院急診部門、診室和救護車，其中要求小樣品體積、易于使用、快速以及高靈敏度。

定義

本文所用的術語“抗體”指任何同種型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)的多克隆和/或單克隆抗體或其抗原結合部分，包括但不限于F(ab)和Fv片段、單鏈抗體、嵌合抗體和人源化抗體。

本文所用的術語“分析物”指要確定其濃度或存在的任何分子。靶分子的實例為分子靶標，例如肽、蛋白、激素、DNA、RNA和酶。術語“分析物”和“靶標”在本申請中可互換使用。

本文所用的術語“同源”指肽或蛋白與所述肽或蛋白基本上相似。術語“基本上相似”為本領域技術人員所公知。特別地，變體可以是與人群體中最優勢的肽同種型的氨基酸序列相比表現出氨基酸交換的同種型或等位基因。優選地，這樣的基本上相似的肽與所述肽最優勢的同種型的序列相似性為至少70％，優選至少80％、85％、90％、95％、97％、98或99％。基本上相似還指降解產物，如蛋白水解降解產物，其仍然被諸如抗體的結合部分或被針對各自的全長肽的配體所識別。術語“變體”還指剪接變體。

本文所用的術語“固體基底”指對相同表位不具有特異性的捕獲部分所結合的基底。術語“固體基底”和“固體支持物”在本申請中可互換使用。

本文所用的術語“結合部分”分別指表位特異性檢測部分或者對相同表位不具有特異性的捕獲部分。

本文所用的術語“表位特異性檢測部分”指結合諸如分析物蛋白的給定靶標的一個相同表位的至少一個部分。

這樣的表位特異性檢測部分例如單克隆抗體、表位特異性適體、表位特異性anticalin、表位特異性凝集素、表位特異性親和體(affibody)、表位特異性化學配體或表位特異性肽。術語“表位特異性檢測部分”和檢測部分在本申請中可互換使用。

本文所用的術語“對相同表位不具有特異性的捕獲部分”指結合給定靶標的不同表位，或者結合給定靶標的相同表位的不同亞區的至少兩個部分的集合。一個部分結合給定靶標的表位的氨基酸1-10，而結合相同表位的氨基酸2-11的第二部分的兩個部分因而充當本發明表述中“對相同表位不具有特異性的捕獲部分”。