[發(fā)明專利]基因序列分析的方法和試劑

有效

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• 申請日: 2010-08-10
• 公開（公告）號: CN102471364A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發(fā)明（設計）人: 桑原正靖;梶山智晴;神原秀記
• 申請（專利權）人: 株式會社日立制作所;國立大學法人群馬大學
• 主分類號: C07H19/20
• 分類號: C07H19/20;C12Q1/68
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶;於毓楨

技術領域

本發(fā)明涉及核酸分析和基因的堿基序列分析的方法，具體涉及基因序列分析、基因多型分析、基因變異分析和基因表達分析的方法。

背景技術

在DNA的堿基序列的確定中，使用凝膠電泳和熒光檢測的方法被廣泛應用。在該方法中，首先制備許多想要進行序列分析的DNA片段的拷貝。以DNA的5′末端作為起點制備各種長度的熒光標記片段。此外，預先加入根據(jù)這些DNA片段的3′末端的堿基種類而波長不同的熒光標記。通過凝膠電泳識別1個堿基差異的長度差，檢測每個片段組產生的發(fā)光。由發(fā)光波長顏色而獲知測定中的DNA片段組的DNA末端堿基種類。由于DNA從短的片段組開始依次通過熒光檢測部，所以可以通過測量熒光顏色而自短的DNA開始依次獲知末端堿基種類。由此進行序列確定。這樣的熒光式DNA序列測定儀正在廣泛地普及，另外，在人類基因組的分析中也非?；钴S。在該方法中，公開了使用許多根內徑50μm左右的玻璃細管，進一步利用末端檢測等方法，增加每臺的分析處理數(shù)的技術。

另一方面，利用以焦磷酸測序法為代表的分步的化學反應的序列確定法(例如專利文獻1和非專利文獻2)，由于處理的簡便性而受到關注。圖13(1)是表示其工序的例子。概要如下。使引物雜交至作為靶物質的DNA鏈，順次將四種互補鏈合成核酸底物(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)一種一種地加入到反應液中，進行互補鏈合成反應。圖13(1)中，連接于引物的3′末端的核酸底物是與靶物質上的堿基C131互補的dGTP。由此，在其他的核酸底物(dATP、dCTP、dTTP)中不發(fā)生延長。加入到反應溶液中、沒用于延長的核酸底物，經以腺苷三磷酸雙磷酸酶為代表的核酸底物分解酶而被分解。如圖13(1)的dGTP注入時那樣，如果發(fā)生互補鏈合成反應則DNA互補鏈延長，生成作為副產物的焦磷酸(PPi)。此時的反應式示于圖13(2)。焦磷酸通過共存的酶的作用而轉化為ATP，在熒光素和熒光素酶的共存下反應，產生發(fā)光(生物發(fā)光)。

如果圖示每次各底物注入的發(fā)光，以圖14作為例子。通常，使用該發(fā)光曲線，通過分析每次加入的核酸底物時產生的發(fā)光，獲知加入的互補鏈合成底物是否被并入DNA鏈，并且獲知互補鏈的序列信息并因此獲知成為靶物質的DNA鏈的序列信息。

已知：作為1種互補鏈合成核酸底物，dATP與作為生物發(fā)光底物的ATP具有類似的結構，因此作為熒光素酶的底物而起作用。這成為背景發(fā)光信號，使得檢測靈敏度降低。作為對策，Nyren等人公開了利用dATP的類似物、具體為dATPαS來代替dATP(專利文獻1)。

上述Nyren等人的方法減少了焦磷酸測序法中的背景發(fā)光，為提高分析時的發(fā)光檢測性能做出了貢獻。但是，使用含有dATPαS的核苷酸α-硫代三磷酸類似物的方法也有缺點。缺點之一是磷酸基部分的Rp異構體引起的酶活性抑制。Nyren等人對此進行了詳細地公開(專利文獻3和非專利文獻2)，Rp異構體可能抑制聚合酶活性，并且Rp異構體不能被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解。作為對策，Nyren等人公開了首先僅對Sp異構體進行精制而利用的技術。另外，剩余的Sp異構體被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解為核苷酸α-硫代一磷酸類似物，此后，當其中的一部分通過酶被再合成為核苷酸α-硫代三磷酸類似物時，Sp/Rp異構體的合成確定是各50％，因此針對Rp異構體合成累積的問題，通過堿性磷酸酶分解Rp異構體并除去。Nyren等人公開了可以通過該方法避免由于Rp異構體引起的聚合酶延長抑制。

進一步地，Eriksson等人公開了作為用于代替dATP的核酸底物，使用7-脫氮-2-脫氧腺苷三磷酸(C⁷dATP)的方法(非專利文獻3)。C⁷dATP是將腺嘌呤基的7位氮替換為碳后的物質。因此，三磷酸結構與dATP相同，容易被腺苷三磷酸雙磷酸酶分解。即，與作為現(xiàn)有技術的核苷酸α-硫代三磷酸類似物不同，不存在被考慮為酶抑制的主要因素的光學異構體。由此，Eriksson等人公開了可以沒有酶抑制的核酸序列分析。

另一方面，雖然在由焦磷酸生成ATP的反應中使用APS，但這也成為熒光素酶反應的底物，產生背景發(fā)光。因此，為了高靈敏度地實施堿基序列確定，期望不使用APS的方法。作為使之成為可能的方法，公開了使用酶丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)的逆反應，利用AMP和PPi合成ATP的反應的堿基序列確定法(專利文獻4)。由于沒有使用在現(xiàn)有技術中被指出作為背景發(fā)光成分的APS，該方法可以顯著地減少背景發(fā)光，實現(xiàn)高靈敏度的檢測。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻