[發明專利]核酸遞送組合物及其使用方法

無效

• 申請號: 201080034240.3
• 申請日: 2010-06-01
• 公開（公告）號: CN102459302A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 史蒂文·F·道蒂;布萊恩·米德;K·戈戈伊
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞大學董事會
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C12N15/113;A61K31/7105;A61K48/00
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 陳建芳;閻娬斌

相關申請的交叉參考

本申請要求于2009年6月1日提交的美國臨時申請號61/182,832的優先權，該申請的公開內容通過引用合并入本文。

技術領域

本公開書涉及用于轉導細胞的組合物和方法。

背景技術

已經使用各種各樣的重組病毒載體、脂質遞送系統和電穿孔在體外和體內進行核酸至細胞的遞送。這些技術通過敲除基因表達或提供用于基因治療的遺傳構建物設法治療各種疾病和病癥或研究不同的生物系統。

聚陰離子寡聚物諸如寡核苷酸不容易跨細胞膜擴散。為了克服培養細胞的這個問題，陽離子脂質與陰離子寡核苷酸結合以幫助攝取。不幸的是，該復合物對細胞通常是有毒的，這意味著必須小心地控制陽離子脂的暴露時間和濃度，以保證活細胞的轉染。

作為選擇性降解mRNA的細胞機理的RNA干擾的發現使得可以靶向操作細胞培養物的表型和發展定向治療技術(Behlke，Mol.Ther.13，644-670，2006；Xie等人，Drug?Discov.Today?11，67-73，2006)。然而，由于它們的大小和負(陰離子)電荷的性質，siRNA是不能進入細胞的大分子。實際上，siRNA超過了Lipinski的用于細胞遞送膜可擴散分子的“5s規則”(Rule?of?5s)的25倍，在該規則中，通常膜可擴散分子限制為小于500Da的尺寸。因此，在不存在遞送載體或轉染劑時，裸露的siRNA不進入細胞，即使在毫摩爾的濃度下也不能(Barquinero等人，Gene?Ther.11?Suppl?1，S3-9，2004)。重要的關注集中在使用陽離子脂質上，其凝聚siRNA并在細胞膜上打孔來解決siRNA的遞送問題。盡管已經廣泛使用，但轉染劑不能實現有效地遞送到許多細胞類型，尤其是原代細胞和造血細胞系中(T細胞和B細胞，巨噬細胞)。而且脂質轉染試劑經常導致不同程度的細胞毒性，從腫瘤細胞中的輕度到原代細胞中的高度的細胞毒性。

發明內容

本公開書提供了用于將掩蔽的寡核苷酸或多核苷酸遞送到活細胞中的方法和組合物。本發明提供了短暫保護的寡核苷酸或多核苷酸，其包含陰離子電荷中和部分/基團。在一個實施方案中，所述電荷中和部分包含堿性/陽離子電荷。在另一個實施方案中，所述部分包括沿本發明的三酯保護基團的伯胺、仲胺或叔胺。這些化合物可以通過胞吞或大型胞飲機制進入活細胞的細胞胞質。在一個實施方案中，所述磷酸三酯保護/中和基團當暴露于細胞內環境時，被設計成通過酶活性或通過被動的細胞內方法(例如，pH改變)除去，以提供能夠誘發RNAi應答的寡核苷酸或多核苷酸。因此，本發明提供了可用作治療劑、診斷劑和作為研究工具的寡核苷酸前藥。

本公開書提供了RNAi誘導的單個可溶性核糖核酸堿(siRNB)分子。在一些實施方案中，siRNB分子與肽轉導結構域(PTD)細胞遞送肽(PTD-siRNB)綴合，所述肽轉導結構域(PTD)細胞遞送肽(PTD-siRNB)＜2x10⁴Da。RNB亞磷酰胺結構單元被改造從而包含生物學可逆的氨基異丁基S-酰基硫代乙基堿性磷酸三酯，其被細胞質硫酯酶特異性地去除，導致反轉為野生型磷酸二酯。自遞送的PTD-siRNB在培養的原代和轉化細胞的全部群體中誘導快速的RNAi應答，并且在小鼠模型的鼻和上呼吸道中體內誘導RNAi應答。PTD-siRNB代表一種新型的誘導RNAi應答的單個可溶性分子方式。

本公開書提供了伯胺基團形式(pKa＞9.0)的堿性(正)電荷，其使RNB可溶于水中，并且不會被PTD遞送肽從溶液中驅除。

本公開書提供了在電荷中和的寡核苷酸中使用的修飾核苷酸。核苷酸包含與核苷酸的磷酸基團綴合的氨基烷基S-酰基硫代烷基(“電荷中和部分”或“N-SATE”)。中和基團協助包含所述修飾的核苷酸的寡核苷酸跨細胞膜運輸。一旦被細胞攝取，所述中和基團被例如內源性或外源性硫酯酶去除。

在一個實施方案中，用于將N-SATE添加至寡核苷酸(例如，和RNA寡核苷酸)的結構單元包含電荷中和部分，所述電荷中和部分具有下列通式結構：

其中R是氨基或末端為氨基的1-7個原子的烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、環烷基、取代的環烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、雜環或取代的雜環。前述結構可以在生成siRNB分子的RNA合成反應期間加入。

在一個實施方案中，所述電荷中和部分包含具有下列通式結構的N-SATE：