[發明專利]改善的人長五聚環蛋白3表達系統及其用途有效

申請號：	201080034030.4	申請日：	2010-07-20
公開（公告）號：	CN102549160A	公開（公告）日：	2012-07-04
發明（設計）人：	M·薩薩諾;A·埃斯普斯托;V·瑞維希奧;G·卡薩尼	申請（專利權）人：	泰克諾根股份公司
主分類號：	C12N15/79	分類號：	C12N15/79;C12N15/67;C12N5/16
代理公司：	中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038	代理人：	袁泉
地址：	意大利***	國省代碼：	意大利;IT
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摘要：
搜索關鍵詞：	改善人長五聚環蛋白表達系統及其用途
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及能夠表達高水平人五聚環蛋白3(hPTX3)的源自人的細胞系統、所用的方法和材料。

背景技術

人長五聚環蛋白3，PTX3或hPTX3(GeneBank登錄號BD131701)，是一種由二硫鍵連接的8個亞基組成的多聚體糖蛋白。

本發明的作者已經設計了用于在HEK293F人細胞系中生產PTX3的表達系統。該系統基于含有新霉素抗性基因的質粒，其中PTX3基因在人遍在蛋白C啟動子序列的控制下。此系統避免了源自非人源細胞系內源產生PTX3的嵌合PTX3的潛在形成。在所獲得的那些生產克隆當中選出最佳的生產分離克隆，名為2F12。獲得了約20mg/L?PTX3的產量，這對商業生產需要而言是不夠的。

為增加PTX3表達水平，本發明的作者已經構建其中PTX3基因在CMV啟動子控制下的質粒。該質粒用來再轉染表達PTX3的克隆2F12。在新的分離轉染瘤(transfectoma)中檢測到的生產率水平高于預期，約80mg/L。

發明描述

使用實驗策略獲得表達高水平人PTX3的人源克隆，所述實驗策略包括以下步驟：

a)構建攜帶在CMV啟動子控制下的人PTX3的質粒表達盒；

b)在所述質粒中插入潮霉素抗性盒，以選擇穩定的轉染瘤，所述轉染瘤源自G418抗性的PTX3表達克隆的再轉染；

c)驗證表達的重組蛋白的身份(identity)和水平；

d)生物化學表征重組hPTX3。

PCT/EP2009/050937的內容因而通過引用的方式并入。

本發明的目的是基本上具有SEQ?ID?1的序列的真核表達載體，其包含在有效啟動子控制下的編碼人長五聚環蛋白PTX3的核苷酸序列和編碼可選擇標記的核苷酸序列。

該載體優選地用來轉化宿主細胞，優選地其中宿主細胞是已經能夠表達人長五聚環蛋白PTX3的重組人細胞，更優選地其中重組人細胞是在ECACC以編號08011001保藏的重組293F/PTX3/2F12克隆。在具體的方面，該載體被線性化。

本發明的另一個目的是能夠表達由如上所公開的載體編碼的人長五聚環蛋白PTX3的重組細胞，優選地該重組細胞是重組HEK293F細胞系，更優選地，它是在英國索利茲伯里健康保護署應急準備和響應培養物保藏中心(Health?Protection?Agency，Culture?Collections?Centre?For?Emergency?Preparedness?and?Response?Salisbury?UK)以編號09072902保藏的重組MS24PTX克隆。

本發明的另一個方面是如上文所公開的重組細胞用于生產人長五聚環蛋白PTX3的用途。

本發明的另一個目的是用于生產重組人長五聚環蛋白PTX3的方法，其包括：

a)用其中人長五聚環蛋白基因在CMV啟動子控制下的可選擇質粒轉染已經表達重組人長五聚環蛋白PTX3的重組人細胞；

b)選擇并且培育轉染的重組人細胞；

c)從轉染的重組人細胞的培養基純化人長五聚環蛋白PTX3。

優選地，表達重組人長五聚環蛋白PTX3的重組人細胞是重組HEK293F細胞系，更優選地，它是在ECACC以編號08011001保藏的重組293F/PTX3/2F12克隆。

在優選的實施方式中，純化步驟包括以下步驟的至少一者：陰離子交換層析、羥基磷灰石層析或尺寸排阻層析。

本發明的另一個目的是用于生產重組人長五聚環蛋白PTX3的方法，其包括：

a)用基本上具有SEQ?ID?1的序列的第一載體和用基本上具有SEQ?ID?2的序列的第二載體同時或依次地共轉染人細胞；

b)選擇并且培育雙重轉染的細胞；

b)從雙重轉染的細胞的培養基純化人長五聚環蛋白PTX3。

本發明的另一個目的是用于生產重組人長五聚環蛋白PTX3的方法，包括培育重組MS24PTX克隆并且從培養基純化人長五聚環蛋白PTX3的步驟。