[發(fā)明專利]硝基還原酶的新型酶底物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080033838.0
• 申請(qǐng)日: 2010-07-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102482707A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: O·法布雷加;A·詹姆斯;S·歐倫加;J·佩里;V·L·薩爾瓦圖拉;S·斯坦福斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12Q1/26
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 過(guò)曉東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)硝基還原酶活性的新型酶底物。這些底物可用在特別是微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、組織學(xué)等包括產(chǎn)生物理化學(xué)信號(hào)的酶還原步驟的應(yīng)用中。

背景技術(shù)

目前存在非常多的能夠檢測(cè)微生物的培養(yǎng)基。該檢測(cè)可特別地基于特定底物的使用，所述底物對(duì)于期待檢測(cè)的微生物中的酶具有特異性。通常，對(duì)酶的合成性底物的制備方式是使底物和它通過(guò)靶酶代謝的產(chǎn)物具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，所述性質(zhì)使得能夠?qū)⑺鼈儏^(qū)分，并能夠評(píng)價(jià)是否所有或部分的底物已通過(guò)酶轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。例如，酶代謝的產(chǎn)物可以是生色或熒光的。由此，在細(xì)菌的情況中，通過(guò)底物的選擇，根據(jù)是否存在反應(yīng)，可表征微生物的性質(zhì)。硝基還原酶活性可特別地用于鑒定細(xì)菌群、屬或種。還可將其用于監(jiān)測(cè)微生物的還原性代謝，如與它們的生長(zhǎng)或抑制這樣的生長(zhǎng)相關(guān)的還原性代謝。

多年來(lái)已知一些細(xì)菌具有還原硝基芳族化合物的能力。Asnis(1957)報(bào)道了從大腸桿菌提取物中分離黃素蛋白，黃素蛋白能夠還原對(duì)硝基苯甲酸。從這篇報(bào)道開(kāi)始，在各種生物體中已鑒定出硝基芳基還原酶活性。這包括嚴(yán)格需氧菌如假單胞菌屬(Pseudomonas)(Won等人，1974)和諾卡菌屬(Nocardia)(Villanueva，1964)、嚴(yán)格厭氧菌如梭菌屬(Clostridium)(Ancermaier和Simon，1983)和韋榮氏球菌屬(Veillonella)(McCormick等人，1976)或真菌(Masuda和Ozaki，1993)和真核寄生蟲(chóng)(Douch，1975)。存在著一些被指認(rèn)能夠被細(xì)菌性硝基芳基還原酶還原的底物。這些底物尤其為硝基芳族化合物，例如對(duì)硝基苯甲酸、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。

通常通過(guò)間接方法如監(jiān)測(cè)底物或共因子的消失對(duì)硝基還原酶的酶活性進(jìn)行檢測(cè)。例如，Kitamura等人(1983)已研究了對(duì)硝基苯甲酸甲酯和一些其他的硝基芳族化合物與大腸桿菌提取物的還原。但是，該方法不是非常靈敏，并且不適于在非均相培養(yǎng)基中的檢測(cè)。還可提及申請(qǐng)WO?00/28073，其描述了用于直接檢測(cè)硝基芳基還原酶活性的基于硝基香豆素的熒光底物。該類型的硝基芳族化合物能夠在還原后產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的化合物，因此該化合物可易于檢測(cè)。但是，該底物不能很好地適于非均相培養(yǎng)基中的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明提出對(duì)可進(jìn)行微生物檢測(cè)的硝基還原酶底物的改進(jìn)。相對(duì)于現(xiàn)有的底物，這些新型底物易于合成，并且可以特別地用于微生物檢測(cè)的凝膠培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生在反應(yīng)培養(yǎng)基中不擴(kuò)散的顏色。

此外，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)在于本發(fā)明的化合物可進(jìn)行的微生物檢測(cè)，同時(shí)顯示出硝基還原酶活性和引起培養(yǎng)基的pH變化的代謝。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，給出以下定義以有助于本發(fā)明的公開(kāi)。

“酶底物”是指這樣的底物，其可被酶改變成允許直接或間接地檢測(cè)微生物、細(xì)胞或細(xì)胞器的產(chǎn)物。在硝基還原酶底物的情況中，該底物特別包括硝酸酯官能團(tuán)，該官能團(tuán)可被待檢測(cè)的酶活性部分或全部地還原，這樣的硝酸酯官能團(tuán)的還原改變分子的某些物理化學(xué)性質(zhì)，使得能夠監(jiān)測(cè)該還原。

本發(fā)明的底物適用于流式細(xì)胞術(shù)，因?yàn)橛捎谄溥€原產(chǎn)物主要保留在表達(dá)酶活性的細(xì)胞內(nèi)，可以特定地對(duì)表達(dá)該活性的細(xì)胞計(jì)數(shù)，或者甚至將它們從樣品的其余部分中分離。

本發(fā)明的底物還較好地適用于組織酶學(xué)，這是因?yàn)橛捎谶€原產(chǎn)物主要保留在還原位點(diǎn)處，所以可特異性地鑒定在組織中表達(dá)該活性的細(xì)胞或細(xì)胞器。

由于它們的低毒性，本發(fā)明的底物較好地適于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的硝基還原酶活性的監(jiān)測(cè)。

本發(fā)明的底物特別良好地適用于培養(yǎng)基的檢測(cè)和/或鑒定，這是因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生在反應(yīng)培養(yǎng)基中不擴(kuò)散的顏色或熒光。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“顏色”包括在可見(jiàn)光譜中的顏色、光吸收或在某波長(zhǎng)(λ_ex)下吸收且在更高波長(zhǎng)下激發(fā)的熒光。

本發(fā)明的底物可以是鹽化的，即可以為如氯鹽、溴鹽、碘鹽、鉀鹽或三氟乙酸鹽的鹽形式。

術(shù)語(yǔ)“pH指示劑”應(yīng)理解是指顏色和/或熒光根據(jù)培養(yǎng)基的pH變化而改變的化學(xué)物質(zhì)，所述變化與在所述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物的代謝相關(guān)或不相關(guān)。

“硝基還原酶”應(yīng)理解是指可全部或部分還原NO₂基的酶。