[發明專利]硝基還原酶的新型酶底物

有效

• 申請號: 201080033830.4
• 申請日: 2010-07-29
• 公開（公告）號: CN102482705A
• 公開（公告）日: 2012-05-30
• 發明（設計）人: A·詹姆斯;S·歐倫加;J·佩里;V·L·薩爾瓦圖拉;S·斯坦福斯
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/26
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 過曉東

技術領域

本發明涉及用于檢測硝基還原酶活性的新型酶底物。這些底物可用在特別是微生物學、生物化學、免疫學、分子生物學、組織學等包括產生物理化學信號的酶還原步驟的應用中。

背景技術

目前存在非常多的能夠檢測微生物的培養基。該檢測可特別地基于特定底物的使用，所述底物對于期待檢測的微生物中的酶具有特異性。通常，對酶的合成性底物的制備方式是使底物和它通過靶酶代謝的產物具有不同的物理化學性質，所述性質使得能夠將它們區分，并能夠評價是否所有或部分的底物已通過酶轉化為產物。例如，酶代謝的產物可以是生色或熒光的。由此，在細菌的情況中，通過底物的選擇，根據是否存在反應，可表征微生物的性質。硝基還原酶活性可特別地用于鑒定細菌群、屬或種。還可將其用于監測微生物的還原性代謝，如與它們的生長或抑制這樣的生長相關的還原性代謝。

多年來已知一些細菌具有還原硝基芳族化合物的能力。Asnis(1957)報道了從大腸桿菌提取物中分離黃素蛋白，黃素蛋白能夠還原對硝基苯甲酸。從這篇報道開始，在各種生物體中已鑒定出硝基芳基還原酶活性。這包括嚴格需氧菌如假單胞菌屬(Pseudomonas)(Won等人，1974)和諾卡菌屬(Nocardia)(Villanueva，1964)、嚴格厭氧菌如梭菌屬(Clostridium)(Ancermaier和Simon，1983)和韋榮氏球菌屬(Veillonella)(McCormick等人，1976)或真菌(Masuda和Ozaki，1993)和真核寄生蟲(Douch，1975)。存在著一些被指認能夠被細菌性硝基芳基還原酶還原的底物。這些底物尤其為硝基芳族化合物，例如對硝基苯甲酸、對硝基苯酚、對硝基苯胺及2，4，6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。

通常通過間接方法如監測底物或共因子的消失對硝基還原酶的酶活性進行檢測。例如，Kitamura等人(1983)已研究了對硝基苯甲酸甲酯和一些其他的硝基芳族化合物與大腸桿菌提取物的還原。但是，該方法不是非常靈敏，并且不適于在非均相培養基中的檢測。還可提及申請WO?00/28073，其描述了用于直接檢測硝基芳基還原酶活性的基于硝基香豆素的熒光底物。該類型的硝基芳族化合物能夠在還原后產生較強熒光的化合物，因此該化合物可易于檢測。但是，該底物不能很好地適于非均相培養基中的檢測。

發明內容

因此，本發明提出對可進行微生物檢測的硝基還原酶底物的改進。相對于現有的底物，這些新型底物易于合成，并且可以特別地用于微生物檢測的凝膠培養基，因為它們產生在反應培養基中不擴散的顏色。

此外，本發明相對于現有技術的改進在于本發明的化合物可進行的微生物檢測，同時顯示出硝基還原酶活性和引起培養基的pH變化的代謝。

在進一步描述本發明之前，給出以下定義以有助于本發明的公開。

“酶底物”是指這樣的底物，其可被酶改變成允許直接或間接地檢測微生物、細胞或細胞器的產物。在硝基還原酶底物的情況中，該底物特別包括硝酸酯官能團，該官能團可被待檢測的酶活性部分或全部地還原，這樣的硝酸酯官能團的還原改變分子的某些物理化學性質，使得能夠監測該還原。

本發明的底物適用于流式細胞術，因為由于其還原產物主要保留在表達酶活性的細胞內，可以特定地對表達該活性的細胞計數，或者甚至將它們從樣品的其余部分中分離。

本發明的底物還較好地適用于組織酶學，這是因為由于還原產物主要保留在還原位點處，所以可特異性地鑒定在組織中表達該活性的細胞或細胞器。

由于它們的低毒性，本發明的底物較好地適于對細胞培養物的硝基還原酶活性的監測。

本發明的底物特別良好地適用于培養基的檢測和/或鑒定，這是因為它們產生在反應培養基中不擴散的顏色或熒光。在本申請中，術語“顏色”包括在可見光譜中的顏色、光吸收或在某波長(λ_ex)下吸收且在更高波長下(λ_em，)激發的熒光。

本發明的底物可以是鹽化的，即可以為如氯鹽、溴鹽、碘鹽、鉀鹽或三氟乙酸鹽的鹽形式。

術語“pH指示劑”應理解是指顏色和/或熒光根據培養基的pH變化而改變的化學物質，所述變化與在所述培養基上生長的微生物的代謝相關或不相關。

“硝基還原酶”應理解是指可全部或部分還原NO₂基的酶。