[發明專利]通過質譜對蛋白質進行定量的新方法

有效

• 申請號: 201080032927.3
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN102483420A
• 公開（公告）日: 2012-05-30
• 發明（設計）人: 熱羅姆·勒穆瓦納;阿諾·薩爾瓦多;J-P·沙里耶;唐吉·福爾坦
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司;克洛德·貝納爾-里昂第一大學;國家科學研究中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;菅興成

技術領域

本發明涉及蛋白質定量測定的技術領域。特別地，本發明涉及一種通過質譜進行蛋白質定量測定的新方法。

已經開發了許多用于蛋白質定量測定的技術，諸如來自患者的血液樣品(血清、血漿)的復雜流體中的蛋白質測定在診斷中至關重要。ELISA(酶聯免疫吸附測定)目前使用最為廣泛。在多種已知的ELISA技術中，夾心反應使用最為廣泛。該反應需要用于目的蛋白的兩種抗體，其中一種與酶結合。最近，本申請人(T.Fortin?et?al.，MCP，2008?E-pub)和其他人(L.Anderson?&?C.Hunter，MCP，2006，573-588；H.Zhang?et?al.，MCP，2007，64-71)已經驗證了對復雜流體中的蛋白質的定量測定，所述測定在數個SRM測定同時進行的情況下通過諸如SRM(選擇反應監測)或MRM(多反應監測)的質譜技術通過其蛋白水解肽而進行。在質譜測定之前，通過酶的方式消化待測定蛋白質，以使蛋白質裂解為肽。然后，通過質譜測定被稱為蛋白水解肽的蛋白質特異性肽。

SRM或MRM與ELISA測定相比的優點在于開發該測定法所花的成本和時間大大降低，特別是在必須開發ELISA測定所需的抗體的情況下更是如此。因此，這類質譜技術似乎是用于測定蛋白質的可選方法，并且使得能夠例如更簡單和更快速地證實測定由蛋白質組分析的研究而鑒定為潛在標記的眾多蛋白質的臨床優點(S.Carr?&?L.Anderson，Clin.Cem.2008，1749-1752)。

在MRM測定的情況下，在三極四聯質譜儀(特別是適于MRM模式的)中，根據下文詳細描述的原則對蛋白水解肽進行定量。首先，將待測定的含肽樣品引入至電離源，所述肽在此于氣態下電離，并被轉化為與起始肽對應的具有一個、兩個或甚至三個另外的質子且因此攜帶一個、兩個或甚至三個電荷的“分子”離子。例如，借助于電噴射型電離源，所述肽被電離的同時在從液態轉化為氣態(Gaskell，Electrospray：principles?and?practise，J.Mass?Spectrom.(1997)，32，677-688)。當通過反相液相色譜預先對所述肽進行分離時，該類型的電離源特別合適。盡管如此，肽電離率仍可根據存在的不同分子的濃度和性質而變化。該現象通過本領域技術人員公知的基質效應而反映。另外，還可借助于MALDI(基質輔助激光解吸電離)源從固態電離肽。

其次，四極分析儀(Q1)使得能根據其質量/電荷比(m/z)來過濾蛋白水解肽。僅具有所尋求的蛋白水解肽的質量/電荷比的肽(該比被稱為(m/z)₁)被傳遞至第二極(q2)并作為用于隨后裂解的前體離子。

q2分析儀使得能將質量/電荷比為(m/z)₁的肽裂解為第1代片段離子。通常通過使用惰性氣體(例如氮氣或氬氣)碰撞前體肽而獲得所述裂解。

第1代片段離子被傳遞至第三四極(Q3)，該第三四極根據特定的質量/電荷比過濾第1代片段離子，所述比被稱為(m/z)₂。僅具有所尋求的蛋白水解肽所特有的片段的質量/電荷比(m/z)₂的第1代片段離子被傳遞至檢測器以進行定量。

該操作模式在關系上具有雙重選擇性，一方面，是對于前體離子的選擇，另一方面，是對于第1代片段離子的選擇。因此，MRM模式的質譜有利于定量。

檢測器中所測定的由第1代片段離子誘發的電流強度與第1代片段離子的量成正比，第1代片段離子的量自身與前體離子的量成正比，前體離子的量自身與待測定的蛋白質的量成正比。因此，所檢測的由第1代片段離子誘發的電流量與待測定的蛋白質的量成正比。盡管如此，仍有必要進行校準，以能夠使所檢測的與第1代片段離子誘發的電流量對應的峰面積與第1代片段離子的相應量具有相關性(或相互關聯)，并最終與待測定的蛋白質的量具有相關性。可在可以MRM模式或MS/MS(或MS²)模式操作的不同質譜模式下測定被稱為“躍遷”的(m/z)₁和(m/z)₂對。通過舉例，可提及的有三聯四極型(L.Anderson?&?C.Hunter，MCP，2006，573-588…)或離子阱型(B.Han和R.Higgs，Brief?Funct?Genomic?Proteomic.2008?Sep；7(5)：340-54)或飛行時間型(MALDI-TOF)(K.-Y.Wang?et?al.，Anal?Chem，2008，80(16)6159-6167)模式。