[發(fā)明專利]一種制備非線性梯度色譜法及其純化的產(chǎn)物

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080030652.X
• 申請(qǐng)日: 2010-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN102471367A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尼特斯·戴夫;德夫什·拉德哈克里什南;蘇恩達(dá)雷什·尚卡爾;克里薩納海坦亞·古拉;哈里什·耶爾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 拜康有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/16
• 分類號(hào): C07K1/16;C07K1/20;B01D15/08;C07K14/62
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 張英;劉書芝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種通過(guò)離子交換/反相色譜介質(zhì)的制備色譜純化蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明一般涉及色譜法，以及更具體地，涉及非線性梯度制備色譜分離目標(biāo)和副產(chǎn)物材料的方法，該方法提供更好的分離度用于分離從而獲得更高純度的目標(biāo)化合物。另外，也公開了一種通過(guò)使用非線性梯度洗脫的RPHPLC純化胰島素類似物或衍生物的方法。

背景技術(shù)

從不斷發(fā)展的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)新興的生物蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)通過(guò)色譜純化處理存在新的挑戰(zhàn)。通常，這些產(chǎn)物很大并且不穩(wěn)定，具有分子量的范圍為10⁴至10⁶道爾頓。這類產(chǎn)物從常常包含數(shù)百種污染物種(包括細(xì)胞碎片、各種溶質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分、DNA和其他雜質(zhì))的混合物中純化。蛋白質(zhì)產(chǎn)物在收獲液(harvest?liquor)中的濃度有時(shí)低達(dá)1mg/l，但通常是大約100mg/l。存在于加工溶液(process?liquor)中的蛋白酶和它們不穩(wěn)定的性質(zhì)常常要求盡可能快地進(jìn)行純化。

色譜是動(dòng)態(tài)的分離方法，依賴于待分離的組分在兩相(固定(或結(jié)合)相床和流動(dòng)(或載體)相)之間的分布。流動(dòng)相載著待分離的組分通過(guò)填充固定相的柱子。色譜技術(shù)包括基于離子交換、疏水相互作用等的分離。在反相色譜(RPC)中，溶液中的分子結(jié)合到色譜樹脂的疏水表面或疏水配體。

可應(yīng)用一些不同的色譜程序以獲得關(guān)于純度和產(chǎn)率的期望的最終結(jié)果。反相色譜是采用的利用疏水相互作用作為主要分離原理的純化中的最有效的方法之一。反相液相色譜(“RP-LC”)和反相高效液相色譜(“RP-HPLC”)通常用于純化分子，例如通過(guò)合成或重組方法生產(chǎn)的肽和蛋白質(zhì)。RP-LC和RP-HPLC方法可以有效地分離緊密相關(guān)的雜質(zhì)，并已用于純化許多不同的分子(Lee等人，“Preparative?HPLC，”8thBiotechnology?Symposium，Pt.1，593-610(1988))。另外，RP-LC和RP-HPLC已成功地用于純化分子，特別是，工業(yè)規(guī)模的蛋白質(zhì)(Olsen等人，1994，J.Chromatog.A，675，101)。

根據(jù)離子交換樹脂上配體的電荷，離子交換色譜原理包括兩種不同的途徑：陰離子交換和陽(yáng)離子交換。傳統(tǒng)的IEC純化方法通常由一個(gè)或多個(gè)階段(sections)組成：平衡階段、施加或負(fù)載階段(application?or?loading?sections)、沖洗階段、洗脫階段，和再生階段(參考Remington’s?Pharmaceutical?Sciences，Gennaro，ed.，Mack?Publishing?Co.，Easton，Pa.，1990，或Remington：The?Science?and?Practice?of?Pharmacy，第19版(1995))。

US?6,451,987公開了一種用于從包含肽和相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽的離子交換色譜方法。

US?7,276,590公開了一種用于從包含肽和相關(guān)雜質(zhì)的混合物中純化肽的離子交換色譜方法。

制備系統(tǒng)的成本已大大升級(jí)。此外，在這些高壓下運(yùn)行的這種系統(tǒng)在日常的生產(chǎn)環(huán)境中使用，這可能是嚴(yán)重的危害。因此，該產(chǎn)業(yè)處于必須在緩慢并且具有有限的純化能力的低壓、低成本的系統(tǒng)，或明顯更昂貴并且對(duì)健康構(gòu)成危害的高壓、高效的系統(tǒng)之間選擇的位置。此外，當(dāng)在制備溶液中時(shí)，熱的或由于蛋白酶等的存在，生物制品可以及時(shí)降解，所以非常期望迅速分離。使用用于生物大分子的液相色譜分離方法獲得的生產(chǎn)效率可以用術(shù)語(yǔ)產(chǎn)品量/美元(amount-of-product/dollar)描述。為了獲得最佳的生產(chǎn)，目前沒(méi)有很好滿足的生產(chǎn)速度和能力是重要的考慮因素。因此，在色譜領(lǐng)域需要不憑借高壓和相關(guān)的危害和高成本而能高效的系統(tǒng)。

當(dāng)該方法可以盡可能重復(fù)色譜方法的產(chǎn)率、純度、產(chǎn)量和操作條件時(shí)，就滿足了該需要，其中洗脫由選擇的溶劑體系、pH范圍和其他相關(guān)因素控制(conduct)。操作程序可以有利地用于商業(yè)分離。已作出努力創(chuàng)制通過(guò)更高的分離度來(lái)表征分離的離子交換/HPLC系統(tǒng)。

因此，當(dāng)單獨(dú)使用或與標(biāo)準(zhǔn)提取和色譜技術(shù)組合使用時(shí)，本發(fā)明的提取方法允許本發(fā)明利用比傳統(tǒng)方法所需更少的步驟以高產(chǎn)率和高純度來(lái)分離分子。

因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于高效分離和純化的制備色譜系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有小規(guī)模和低成本，沒(méi)有傳統(tǒng)的分離和純化系統(tǒng)的弊端。