[發明專利]用于獲得具有增強的草甘膦耐受性的植物的方法和手段

無效

• 申請號: 201080029250.8
• 申請日: 2010-06-24
• 公開（公告）號: CN102471776A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: R·魯伊特;F·莫伊勒韋特;C·范德施特雷滕
• 申請（專利權）人: 拜爾生物科學公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

發明領域

本發明涉及除草劑耐受性植物(更具體地植物如蕓薹屬油料種子植物)領域，這些植物包括指導耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的定量和定性表達的嵌合DNA分子，所述嵌合DNA分子從而對所述植物賦予增強的對于抑制所述EPSPS的除草劑的耐受性。

發明背景

N-膦酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦，是一種熟知的在廣譜的植物種類上具有活性的除草劑。由于它對莽草酸途徑的抑制作用，草甘膦是植物毒性的，該途經提供了用于合成芳香族氨基酸的前體。草甘膦抑制發現于植物和一些細菌中的I型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。在植物中的草甘膦耐受性可以通過表達修飾的I型EPSPS來實現，該修飾的I型EPSPS對于草甘膦具有較低的親和力而在草甘膦存在下仍然保留它的催化活性。耐草甘膦的EPSPS酶的編碼基因在本領域是熟知的，例如在專利申請EP?0?837944和美國專利6,566,587中。在植物中的草甘膦耐受性還可以通過表達對草甘膦展現出耐受性的EPSPS酶類(包括II型或III型EPSPS酶類)來實現。

在植物中的草甘膦耐受的程度實質上是基于EPSPS酶表達的質量和數量，即在處于適當發育階段的適當組織中的足夠數量的EPSPS表達。這些表達質量和數量的參數通過引入到指導EPSPS表達的表達盒中的調控元件來部分地進行控制。一種表達盒必需的調控元件包括啟動子調控序列和終止子調控序列。為了進一步增強表達，表達盒還可以含有以下元件的一種或多種或全部，這些元件選自：引導序列或5’UTR、信號肽或轉運肽、或轉錄激活元件或增強子。在本領域中已經描述了不同的用來提高植物(特別是作物植物，如油菜)中草甘膦耐受嵌合基因的表達的方法。

WO97/004114描述了一種用于轉化植物的嵌合基因。該基因包括在轉錄方向的至少一個啟動子區、一個轉基因以及一個調控區，該調控區的組成為植物組蛋白基因的非編碼5’區的至少一個內含子1，它使得能夠在快速生長區(rapid?growth?region)中表達蛋白質。

WO01/44457披露了含有不同肌動蛋白內含子序列連同PeFMV啟動子的多種植物表達構建體，用于增強轉基因表達(包括EPSPS)。

在WO?07/098042中，描述了單子葉植物啟動子與來自EF1、Act以及ASP基因的雙子葉植物內含子的組合，除了EPSPS以外，這些基因指導草甘膦氧化還原酶(GOX)和草甘膦乙酰轉移酶的表達。

由Chen等人報道了通過CaMV?35S啟動子與EF1α內含子的組合在棉花中增強了CP4?EPSPS的表達(2006，Plant?Biotechnol?J.4(5)：477-87)。

然而，進一步改進在作物植物特別是油菜植物中的草甘膦耐受性是所希望的，并且賦予耐受性增加的可替代嵌合基因或它們的組合是仍然需要的。

本發明通過提供包含組成型啟動子與置換型組蛋白內含子的組合的植物而對本領域作出重要貢獻，該組蛋白內含子指導來自EPSPS編碼區(如在其中已經優化密碼子使用以反映油菜中的密碼子使用的EPSPS編碼區)的耐草甘膦EPSPS酶的表達。包含在這些耐草甘膦嵌合基因中的組蛋白內含子，特別是與如在此所述的密碼子使用優化的EPSPS編碼區的組合，提供了獲得有效的在作物植物特別是油菜植物中的草甘膦耐受性的替代方法。

如在下文在不同的實施方案、實例以及權利要求書中所述解決了這一問題。

發明概述

本發明總體上涉及通過增加耐草甘膦的EPSPS酶的表達質量和數量而具有增強的草甘膦耐受性的植物，該表達是由一種植物可表達的組成型啟動子和一種置換型組蛋白基因的內含子1指導的。本發明還提供了用來產生耐草甘膦的植物的嵌合DNA分子或基因、以及處理本發明的這些植物的方法。

在一個第一實施方案中，提供了包含嵌合DNA分子的多種植物，其中該嵌合DNA分子包含以下可操作地連接的DNA片段：

a)一種植物可表達的組成型啟動子；

b)一個編碼5’UTR的DNA區；

c)一個編碼植物置換型組蛋白基因的內含子1的DNA區；

d)一個編碼轉運肽的DNA區；

e)一個編碼耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的DNA區；以及

f)一個3’轉錄終止和多腺苷酸化區。

根據本發明的另一個實施方案，該植物可表達的組成型啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子。