[發明專利]制備低鐵乳鐵蛋白的方法

有效

• 申請號: 201080028654.5
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN102459328A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 凱文.N.皮爾斯;陳少江
• 申請（專利權）人: 新西蘭威士蘭（西部）乳業公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;A23J3/08;A23J3/32;A61K38/40
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 史悅

技術領域

本發明涉及一種制備低鐵乳鐵蛋白(low-iron?lactoferrin，Lf)的方法，所述低鐵Lf具有比標準Lf更高的抗微生物活性。

背景技術

乳為新生的哺乳動物提供必需的營養物。它還含有用于調理腸胃和其他身體機能、抵御影響健康的微生物的生物活性組分。

Lf是存于乳和初乳中的幾種生物活性組分之一。它還存在于多數外分泌流體，包括淚液和唾液中。Lf具有多種生物功能，包括調節鐵代謝、免疫功能和胚胎發育。Lf對多種病原體包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、酵母和真菌具有抗微生物活性。Lf的抗微生物活性部分歸因于其結合某些細菌生長所必需的鐵的能力。Lf還通過結合細菌膜上的脂多糖(LPS)從而破壞細胞壁來發揮殺菌活性(Ellison等，1988)。LPS是疏水的、帶負電荷的分子，也被稱為內毒素。Lf可以在LPS分離過程中從其環境清除LPS。人們已經發現了從蛋白制備物(Franken等，2000；Petsch和Anspach，2000；Ropp和Murray，2006；Magalhaes等，2007)和從Lf(Rowe等，2006；Naidu，2006?&?2008；Ward等，2009)去除LPS的方法。

Lf已被建議作為抗微生物劑用于乳制品和肉類工業(Payne等，1990；Naidu，2001)。天然Lf是用鐵部分飽和的(Reiter，1985)。一些研究人員(Bishop等，1976；Korhonen，1977；Payne等，1990)報道Lf的抗微生物活性依賴于它的鐵飽和度。Batish等(1988)發現脫輔基-Lf(apo-Lf)的抗菌活性高于天然Lf，而且其他人證實了這一點。

Lf是一種在N端部分(N-terminus?lobe)具有一個鐵結合位點且在C端部分具有另一個鐵結合位點的鐵-結合糖蛋白。在碳酸根離子的協同下，一分子的Lf具有可逆結合兩個高自旋Fe³⁺離子的能力。

開域(domain?opening)幾乎可以肯定是從Lf釋放鐵的必要特征。三個因素引發此過程：i)與特定的Lf受體相互作用，ii)結合的Fe³⁺還原為Fe²⁺，及iii)降低的pH。使用水溶性鐵螯合劑和低pH可以從Lf釋放鐵(Groves，1960；Masson和Heremans，1968；Law和Reiter，1977；Mazurier和Spik，1980；Chung和Raymond，1993；Feng，van?der?Does和Bantjes，1993)。然而，完全去除鐵是困難的，而且脫輔基-Lf的鐵飽和度通常＞10％(Batish等，1988；Payne等，1990；Chung和Raymond，1993)。由于Lf對鐵的高親和力，Kontoghiorghes(1986)無法在生理pH使用任何多種可溶性鐵螯合劑從Lf中完全移動出鐵(Aisen和Leibman，1972；Chung和Raymond，1993；Kretchmar?Nguyen，Craig和Raymond，1993)。一些研究者在pH＜4使用不溶性樹脂來螯合鐵以制備脫輔基-Lf，但是脫輔基-Lf仍然具有約15％的鐵飽和度(Payne等，1990；Chung和Raymond，1993)。雖然Feng，van?der?Does和Bantjes(1995)在檸檬酸和其他緩沖液的存在下，在生理pH用鐵-螯合樹脂從Lf成功地除去了鐵，但其方法復雜、緩慢而且使用的低Lf濃度，這使得將該工藝用于商業用途是不切實際的。Peterson等(2000)顯示直到pH3.5才開始釋放鐵。此外，由于鐵去除過程通常在pH＜3.5進行，這導致因蛋白質沉淀在溶液中產生渾濁(Chung和Raymond，1993)。有時觀察到蛋白構象的修飾(Mazurier和Spik，1980)。

發明目的

本發明目的在于提供一種制備低鐵Lf的方法，或者至少給公眾提供一種有用的選擇。

發明內容

本發明的第一個方面提供一種從液態Lf制備物制備具有改進的抗微生物活性的低鐵Lf的方法，該方法包括使用水混溶性溶劑和使得pH低于約4.5的合適的酸，然后除去鐵、水混溶性溶劑和酸。

優選地，合適的酸是以下任何一種或多種：檸檬酸、酒石酸、草酸、氮川三乙酸或EDTA加酸，例如HCl、H₂SO₄，以將其調整到優選的pH。

優選地，最合適的酸是檸檬酸。

優選地，合適的酸可由檸檬酸鹽和一種或多種有機或無機酸形成。