[發(fā)明專利]高流通量分子轉(zhuǎn)子黏度測定法測定

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080024294.1
• 申請(qǐng)日: 2010-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN102803924A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S-K·李;S·W·拉默;A·R·托波扎達(dá)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號(hào): G01N11/14
• 分類號(hào): G01N11/14
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

優(yōu)先權(quán)

本申請(qǐng)要求2009年6月5日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/184,751的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?jiān)诖艘云湔w引入作為參考。

技術(shù)領(lǐng)域

本組合物和方法涉及實(shí)時(shí)測定懸液中黏度變化的速率。該組合物和方法具有廣泛的應(yīng)用，包括測量淀粉酶介導(dǎo)的淀粉懸液的液化。

背景技術(shù)

旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室中用于評(píng)估α-淀粉酶的淀粉液化性能的標(biāo)準(zhǔn)工具。但是，獲得旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)數(shù)據(jù)的過程緩慢，且需要大量的酶，使得旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定不適于用作工業(yè)蛋白質(zhì)工程的主要篩選方法。備選的直接測量黏度變化的小規(guī)模測定常給出錯(cuò)誤或不可預(yù)測的結(jié)果，也使得它們不適于用作主要篩選方法。因此，存在對(duì)更方便、更準(zhǔn)確和更可重復(fù)的黏度測定的需要。

發(fā)明概述

所描述的是用于實(shí)時(shí)測定懸液黏度變化的高流通量分子轉(zhuǎn)子(molecular?rotor)黏度測定法測定。該方法一般涉及：將分子轉(zhuǎn)子加至包含能夠轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的懸液，其中底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化改變了懸液的黏度；將酶或化學(xué)催化劑加至懸液以起始底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；和測量分子轉(zhuǎn)子的熒光(RFU)；其中可以使分子轉(zhuǎn)子的熒光變化與懸液的黏度變化相關(guān)。此黏度變化可以進(jìn)一步用于測定黏度變化的速率、底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率、轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的量等。

在一方面，提供用于實(shí)時(shí)測定懸液黏度變化的方法，其包括：向包含底物的懸液加入分子轉(zhuǎn)子分子，和能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶或化學(xué)催化劑，該底物能夠轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，該分子轉(zhuǎn)子分子的熒光量子產(chǎn)率依賴于懸液自由體積；和實(shí)時(shí)測量懸液中分子轉(zhuǎn)子分子的熒光；其中底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化改變了通過測量分子轉(zhuǎn)子分子的熒光測定的懸液自由體積，且其中懸液自由體積的變化與溶液黏度的變化相關(guān)。

在一些實(shí)施方案中，用懸液黏度的變化來測定底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的速率。在一些實(shí)施方案中，用懸液黏度的變化來測定轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的量。

在一些實(shí)施方案中，該懸液是淀粉懸液。在一些實(shí)施方案中，該懸液是玉米支鏈淀粉懸液。在其他實(shí)施方案中，該懸液是纖維素懸液，或混合的淀粉和纖維素懸液。

在一些實(shí)施方案中，該酶是糖類加工酶。在一些實(shí)施方案中，該酶是淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶或其組合。在具體實(shí)施方案中，該酶是淀粉酶。

在一些實(shí)施方案中，底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是淀粉酶介導(dǎo)的產(chǎn)生低分子量葡聚糖的淀粉懸液的液化。

在一些實(shí)施方案中，該分子轉(zhuǎn)子分子是9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ)。

在一些實(shí)施方案中，以多孔形式進(jìn)行該方法。在具體實(shí)施方案中，以6孔、12孔、24孔或96孔形式進(jìn)行該方法。

組合物和方法的這些和其他方面及實(shí)施方案將由于描述和附圖而顯而易見。

附圖簡述

圖1顯示淀粉水解反應(yīng)中分子轉(zhuǎn)子熒光(RFU)的減少作為時(shí)間(秒)的函數(shù)的曲線。熒光減少與淀粉水解引起的懸液黏度減小相關(guān)。

圖2顯示用常規(guī)旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測定獲得的峰值黏度數(shù)據(jù)，其確認(rèn)了用分子轉(zhuǎn)子黏度測定法測定獲得的結(jié)果。

發(fā)明詳述

I.定義

在詳細(xì)描述本組合物和方法之前，為了清楚而定義以下術(shù)語和短語。應(yīng)賦予未定義的術(shù)語和短語它們?cè)诒绢I(lǐng)域中使用的普通含義。

本文中使用的“分子轉(zhuǎn)子分子”或簡單的“分子轉(zhuǎn)子”是熒光化學(xué)實(shí)體，其熒光量子產(chǎn)率(即發(fā)射的光子數(shù)除以吸收的光子數(shù))依賴于其微環(huán)境，例如懸液中的自由體積。

本文中使用的術(shù)語“實(shí)時(shí)”指在事件發(fā)生時(shí)對(duì)它進(jìn)行測量。

本文中使用的術(shù)語“淀粉”指包含具有通式(C₆H₁₀O₅)_n的多糖的物質(zhì)，其中多糖的糖取代基主要通過α-D-(1→4)和/或α-D-(1→6)糖苷鍵連接。

本文中使用的術(shù)語“纖維素”指包含具有通式(C₆H₁₀O₅)_n的多糖的物質(zhì)，其中多糖的糖取代基主要通過β-D-(1→4)糖苷鍵連接。

本文中使用的術(shù)語“糖類加工酶”指能夠水解存在于淀粉和/或纖維素組合物中的至少一種成分的任意酶。示例性酶包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶及其組合。