[發(fā)明專利]活化誘導胞苷脫氨酶(AID)突變體及使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201080023311.X
• 申請日: 2010-04-05
• 公開（公告）號: CN102482639A
• 公開（公告）日: 2012-05-30
• 發(fā)明（設計）人: M·王;Z·楊;C·拉達;M·紐伯格
• 申請（專利權）人: 醫(yī)學研究會
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N9/78;C12N15/00;A01K67/027
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

相關申請的交叉引用

本專利申請要求于2009年4月3日提交的美國臨時專利申請第61/166,349號的權益，其援引加入本文。

電子提交材料的援引加入

同時提交的計算機可讀取的核苷酸/氨基酸序列表整體援引加入本文，并且如下所示：一個2010年4月1日創(chuàng)建的名為“SequenceListing.TXT”的140,103字節(jié)的ASCII(Text)文件。

背景技術

產生抗體多樣化的自然機制利用體細胞高變(SHM)的過程以引發(fā)免疫球蛋白可變區(qū)的進化，從而迅速產生與體液應答相關的第二抗體所有組成成分。在體內，SHM代表一個高效的過程，其能夠迅速以代表抗體優(yōu)化的自然過程的方式探索生產性折疊結構并進化出高親和力抗體。因此，對于嘗試在體外復制SHM有很大的興趣，以便創(chuàng)造簡單、穩(wěn)健的方法，其能夠直接在哺乳動物細胞環(huán)境內模擬親和力成熟的自然過程以選擇和進化免疫原性耐受并且在哺乳動物細胞中高表達的抗體(Cumbers?et?al.，Nat?Biotechnol.，20(11)：1129-1134(2002)；Wang?et?al.，Prot.Eng.Des.Sel.，17(9)：569-664(2004)；Wang?et?al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，101(48)：16745-16749(2004)；Ruckerl?et?al.，Mol.Immunol.，43(10)：1645-1652(2006)；Todo?et?al.，J.Biosci.Bioeng.，102(5)：478-81(2006)；Arakawa?et?al.，Nucleic?Acids?Res.，36(1)：e1(2008))。

然而，已從單個人或動物分離的天然抗體常不能證明最佳親和力屬性，因為免疫系統(tǒng)固有的內在親和力上限阻止體內辨別并因此選擇具有大于約100pM親和力的抗體(Batista?and?Neuberger，Immunity，8(6)：751-91998，(1998)和EMBO?J.，19(4)：513-20(2000)。

使用噬菌體展示文庫可以解決一些問題，并且已證實基于噬菌體展示的方法能夠常規(guī)地產生高親和力抗體。然而，從理論角度來看，這樣的靜態(tài)文庫的大小和范圍本質上是有限的，因為即使最大的(10¹²)文庫僅可以探索小部分潛在的先天免疫組成成分。此外，不可以同時在良好的哺乳動物表達和高親和力的基礎上通過噬菌體展示方法共進化抗體，從而引起另外由在哺乳動物宿主細胞中低表達所導致的潛在的下游生產問題。此外，使用隨機誘變結合噬菌體展示缺少在抗體親和力成熟的自然過程中發(fā)現(xiàn)的內在選擇性譜，這常導致人抗人免疫性或不期望的交叉反應性譜的問題。

最初利用人伯基特淋巴瘤細胞系Ramos證實了在體外利用體細胞高變來使用培養(yǎng)細胞系進化特異性靶抗原的抗體(Cumbers?et?al.，Nat.Biotechnol.，20(11)：1129-1134(2002))。Ramos和其他B細胞系還成功地用于進化隨機整合入宿主細胞染色體DNA的非抗體基因(Wang?et?al.，Prot.Eng.Des.Sel.，17(9)：569-664(2004)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，101(48)：16745-16749(2004))。此外，利用有或無Ig特異性順式調控元件的游離型載體在B細胞系中在非抗體基因上證實了高效的體細胞高變(Ruckerl?et?al.，Mol.Immunol.，43(10)：1645-1652(2006))。雖然一些Ramos細胞系表現(xiàn)出相對高的組成型高變率，但是B細胞系一般表現(xiàn)出相對低的細胞分裂速率并且難以高效轉染，這限制了其用于定向進化的實際效用。