[發明專利]用于治療疾病的三環DNA反義寡核苷酸、組合物和方法

在審

• 申請號: 201080022376.2
• 申請日: 2010-04-09
• 公開（公告）號: CN102625840A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 丹尼爾·舒佩利;克里斯蒂安·盧曼;丹尼斯·弗靈;路易斯·加西亞;托馬斯·沃伊特
• 申請（專利權）人: 肌肉學研究協會;巴黎第六大學;伯爾尼大學;法國國家科學研究中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/712
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

發明背景

技術領域

總的來說，本公開涉及合成的反義寡核苷酸(AON)，以及使用反義寡核苷酸改變在pre-mRNA加工期間發生的剪接事件、或下調含有重復序列例如3’或5’CUG、CAG和/或CCUG的突變mRNA的表達的方法。更具體來說，本文公開了三環DNA(tc-DNA)AON，其能夠有效促進pre-mRNA加工期間的外顯子跳躍、掩蔽pre-mRNA中的內含子沉默序列和/或莖-環序列、以及引導RNase介導的mRNA破壞。本文描述了這樣的tc-DNA?AON，通過跳過肌養蛋白基因內突變的外顯子、例如突變的外顯子23或外顯子51以恢復肌養蛋白的功能性，可用于杜氏肌營養不良(Duchenne?Muscular?Dystrophy)的治療方法中。還描述了這樣的tc-DNA?AON，其通過掩蔽SMN2基因內的內含子沉默序列和/或末端莖-環序列，以產生能夠至少部分補償無功能SMN1蛋白、包含由外顯子7編碼的氨基酸序列的修飾的功能性SMN2蛋白，從而可用于脊髓性肌萎縮的治療方法中。此外本文還描述了這樣的tc-DNA?AON，其通過引導對包含3’-末端CUG重復序列的突變DM1?mRNA的破壞，可用于Steinert肌強直性營養不良的治療方法中。因此，tc-DNA?AON以及一種或多種上述方法可用于恢復與肌病相關的蛋白的功能性。

現有技術描述

杜氏肌營養不良(DMD)是最常見的遺傳性肌病，3,500名男性中約有1人患有此病，與種族無關。盡管不太常見，在顯性攜帶者中，女孩和婦女也可表現出類似杜氏肌營養不良的癥狀。DMD的最主要后果是肌纖維變得特別脆，并且自然的肌肉活動就會激起肌肉組織的普遍損傷。在DMD以及許多肌營養不良中觀察到的終點，是緩慢退化導致幾乎完全纖維變性并伴有脂肪浸潤。由于脊柱變形和呼吸困難，在1960年代時的預期壽命約為15歲。在不存在心臟并發癥的情況下，現代在管理方法上的改進(即關節固定術和氣管切開術通氣)已經將預期壽命提高至30歲。

DMD的臨床癥狀在18個月至三歲時變得明顯，包括行走和爬行能力滯后、難以從地板上起立和小腿肚異常增大。在約5至6歲時，在足、膝和髖關節中發生肌肉收縮。疾病發展的特征是持續性肌肉消耗，導致在約9至12歲時喪失行走能力。此外，一些杜氏肌營養不良男孩表現出智力遲鈍，表明缺失的蛋白也與中樞神經系統有關。

杜氏肌營養不良是X染色體連鎖的隱性病。1986年，通過定位克隆方法鑒定到DMD基因座位于X染色體上(Xp21.2-OMIMid：310200)，在編碼被稱為肌養蛋白的蛋白的基因中。肌養蛋白基因中的突變導致在橫紋肌中不能產生肌養蛋白。患病男孩的母親有三分之二的幾率攜帶肌養蛋白突變，而接近三分之一的雙親具有新生突變。一半以上的DMD男孩表現出涵蓋一至幾個外顯子的大基因組缺失；他們中極少數具有大的序列重復。其他人具有難以鑒定的點突變或非常小的缺失或重復。

然而，突變的程度與表型的嚴重性不直接相關。產生提前終止密碼子的框外缺失或無義突變以及隨后翻譯的失敗，導致以嚴重表型為特征的肌養蛋白缺乏。框內缺失造成較輕的肌病，被稱為貝克肌營養不良(Becker?muscular?dystrophy，BMD)。

DMD基因座具有接近250萬個堿基對，是曾經檢測到的最長的基因，但是只有約14,000個堿基對含有編碼序列，其分布在79個外顯子中。全長肌養蛋白(DP?427)是在所有肌肉中表達的427kDa的細胞骨架蛋白，但通過分別位于內含子29、43、55和62中的四個內部啟動子的組織特異性的差異使用(在視網膜、中樞神經系統、外周神經系統和非肌肉組織中)，產生了各種蛋白質同工型(DP?260、DP?140、DP?116、DP?71)。

全長肌養蛋白是肌纖維膜糖蛋白復合物(SGC)的必要組分，所述復合物通過將肌纖維細胞骨架與細胞外基質相連而參與維持肌纖維膜的完整性。序列分析預測肌養蛋白需要幾個結構域和重復序列。大體上說，在N-端存在肌動蛋白雜交位點(N-ABD)；含有可以賦予柔性的4個鉸鏈區段(H)的中央桿結構域(RD；具有24個血影蛋白樣重復序列)；以及靠近C-端(CT)的富半胱氨酸結構域(CRD)，其與DPC的其他成員結合。