[發明專利]具有減少的金屬肽酶表達、適于重組多肽產生的突變細胞

無效

• 申請號: 201080018598.7
• 申請日: 2010-02-25
• 公開（公告）號: CN102414317A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: A.K.尼爾森;M.D.拉斯馬森;N.班克
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12N15/75;C12R1/07
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 史悅

1.一種突變的細菌細胞，所述細胞產生至少一種目標異源多肽，其中所述細胞與其他為同基因的但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表達水平。

2.權利要求1的細胞，其為原核細胞，優選革蘭氏陽性細胞。

3.權利要求2的細胞，其為芽孢桿菌屬細胞。

4.權利要求3的細胞，其為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus?alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus?brevis)、環狀芽孢桿菌(Bacillus?circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus?clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacillus?coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus?lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus?lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus?lichenifprmis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus?stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)細胞。

5.權利要求1-4任一項的細胞，其中所述包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。

6.權利要求1-5任一項的細胞，其在編碼包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。

7.權利要求6的細胞，其中所述基因包含與SEQ?ID?NO：1中所示序列至少70％相同的核苷酸序列的多核苷酸。

8.權利要求1-7任一項的細胞，其在至少一個多核苷酸中有突變，其中所述至少一個多核苷酸的具有至少100bp大小的亞序列在中等嚴格雜交條件下與具有SEQ?ID?NO：1中所示的序列的多核苷酸或其相應互補序列雜交。

9.權利要求6-8任一項的細胞，其中所述基因部分或完全從染色體缺失，或包含至少一個移碼突變或至少一個無義突變。

10.權利要求1-9任一項的細胞，與其他為同基因但非突變的細胞相比，不具有包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的可測量的表達。

11.權利要求1-10任一項的細胞，其中所述至少一種異源多肽包含酶。

12.權利要求11的細胞，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉移酶或異構酶。

13.權利要求1-12任一項的細胞，其與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有目標異源多肽的改善的產生。

14.一種用于構建突變的細菌細胞的方法，所述方法包括下述步驟：

a)使細菌細胞突變；和

b)選擇突變細胞，其與其他為同基因但非突變的細胞相比，具有減少的包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表達水平。

15.權利要求14的方法，其中所述細胞為原核細胞，優選革蘭氏陽性細胞。

16.權利要求15的方法，其中所述細胞為芽孢桿菌屬細胞。

17.權利要求16的方法，其中所述細胞為嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細胞。

18.權利要求14-17任一項的方法，其中所述包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。

19.權利要求14-18任一項的方法，其中步驟(a)中的細胞在編碼包含與SEQ?ID?NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。