[發明專利]用于生產重組多瘤病毒載體粒子的方法

有效

• 申請號: 201080018201.4
• 申請日: 2010-04-22
• 公開（公告）號: CN102695800A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 瓦爾特·杰哈德斯·威利斯德
• 申請（專利權）人: 阿瑪納控股私人有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 張穎;樊衛民

發明領域

本發明涉及用于生產病毒粒子、病毒載體、病毒載體粒子和重組蛋白的改進方法。具體來說，本發明涉及用于生產重組多瘤病毒載體粒子和多瘤病毒載體生產細胞系的改進方法。更具體來說，本發明涉及用于生產猿猴多瘤病毒載體例如猿猴病毒40(SV40)病毒載體的方法。本發明還涉及包含病毒載體的組合物及其與病毒載體粒子在治療遺傳病癥、移植排斥、自體免疫疾病、傳染病、過敏癥或癌癥中的應用。本發明還涉及用于在哺乳動物細胞中生產重組蛋白的方法以及增強哺乳動物細胞中重組蛋白的生產的方法。

發明背景

在過去十年中，大量工作致力于開發用于將基因或核酸導入到靶細胞中并正確表達的有效的基因或核酸遞送技術。治療性基因或核酸可用于恢復功能失常的基因以治療遺傳病癥，誘導免疫應答以治療癌癥和傳染病，或抑制免疫應答例如誘導/恢復免疫耐受性以阻止移植排斥或治療自體免疫疾病和過敏癥。治療性基因或核酸可以作為裸露分子或作為包裝在脂類和/或蛋白質類化合物中的核酸給藥。

因為病毒演化成將它們的遺傳信息遞送并表達在其宿主靶細胞中，因此已探索了將病毒載體作為基因遞送介質，并發現它們是到目前為止將遺傳信息遞送到活細胞中的最有效的手段。已經開發了大量病毒載體基因遞送系統，并在臨床前和臨床試驗中對其進行測試。這些試驗顯示，目前使用的源自于腺病毒、痘病毒、皰疹病毒、甲病毒、反轉錄病毒、細小病毒和多瘤病毒的載體，總體上說是使用安全的，并且能夠有效將治療性基因遞送到靶細胞中。

目前使用的病毒基因遞送載體的主要缺點，是它們不能以足以治療非常大量患者的量生產這一事實。大部分病毒載體通過用編碼載體和載體組分的質粒DNA轉染生產細胞來生產。這一般在每毫升細胞培養物體積中產生1百萬至1千萬個載體粒子。在臨床試驗中，一般必須向患者給藥1x10¹⁰至1x10¹²個載體粒子以便實現有益的臨床效果。這意味著為了治療1000個患者，需要超過1百萬升細胞培養物來產生足夠量的載體粒子。

此外，臨床前和臨床試驗顯示，大多數被測試的病毒基因遞送載體例如腺病毒、痘病毒、皰疹病毒、甲病毒和反轉錄病毒載體，在患者中誘導針對病毒載體組分和治療性基因產物的強免疫應答。結果，這些載體只能單次給藥于患者，然而被導入的治療性基因的表達水平快速降低。源自于腺相關病毒(AAV)的病毒載體不在動物中誘導免疫應答，并且是免疫惰性的。然而，大部分人群在遇到野生型AAV連同其輔助病毒例如腺病毒，由此發展出針對AAV衣殼蛋白的強CTL記憶。結果，AAV轉導的細胞被快速移除，通過AAV載體導入的治療性基因或核酸的表達水平快速降低。

盡管使用了強啟動子和/或多拷貝轉基因插入片段或其他方法來增強轉錄，但在哺乳動物細胞中生產的重組蛋白的產量與在原核細胞中生產的重組蛋白的產量相比，普遍較低。長期以來，病毒復制型載體或復制子已被用作在哺乳動物細胞中生產重組蛋白的表達系統。這樣的載體中的靶基因能夠在病毒啟動子的轉錄控制下表達，由此在轉染后早期即可使所需mRNA在細胞質中積累至極高水平，產生大量靶蛋白。到目前為止，使用基于復制子的表達系統的成功還受到限制。基于RNA病毒的復制子系統一般只能在短時期內生產重組蛋白，而源自于DNA病毒的復制子系統一般在商用細胞系中不能良好復制。

據我們所知，僅有一種病毒基因遞送載體在人類中是免疫惰性的并能夠以足以治療非常大量患者的量生產。此外，這種病毒基因遞送載體可以作為復制子系統用于在哺乳動物細胞系中生產重組蛋白。這種病毒載體系統源自于一種猿猴多瘤病毒，即猿猴病毒40(SV40)。

多瘤病毒包括一組具有二十面體衣殼的無包膜DNA病毒。從各種動物物種中分離到它們，包括人類、猴、嚙齒類和鳥類。已經描述了5種人類多瘤病毒，被稱為BK、JC、WU、KI和梅克爾細胞多瘤病毒。已經描述了許多猴多瘤病毒，其中SV40是最廣為人知的。SV40在人類細胞中復制不良，并罕見感染人類。偶然情況下，通過病毒從猴向與這些動物密切接觸生活的人的傳播，或通過使用被SV40污染的滅活脊髓灰質炎病毒粒子批次進行預防接種，發生SV40感染。