[發明專利]具有蛋白酶識別序列的標簽肽及其應用

無效

• 申請號: 201080018043.2
• 申請日: 2010-04-21
• 公開（公告）號: CN102414218A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 高木淳一
• 申請（專利權）人: 國立大學法人大阪大學
• 主分類號: C07K7/00
• 分類號: C07K7/00;C07K1/14;C07K16/44;C07K19/00;C12N5/10;C12N15/09;C07K1/22;C12P21/08
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 楊青;樊衛民

技術領域

本發明涉及具有蛋白酶識別序列的標簽肽及其應用，具體而言，涉及具有蛋白酶識別序列的標簽肽、編碼該標簽肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的重組載體、針對該標簽肽的抗體、以及使用該抗體的蛋白純化方法。

背景技術

生命科學領域中，在基礎研究、應用研究及產品開發的所有領域中均廣泛進行著利用基因重組技術的蛋白的生產。并且，為了檢測和純化利用大腸桿菌或動物細胞表達的重組蛋白，通常在目標蛋白的末端附加由數個殘基的肽構成的標簽。但是，認為該標簽會對目標蛋白的生物活性、結晶結構等產生影響，因此最終必須將其切除。因此，需要預先在標簽和目標蛋白之間插入特異性的蛋白酶識別序列。

例如，在非專利文獻1中記載了將組氨酸標簽和MBP(麥芽糖結合蛋白)標簽組合、并且進一步附加有煙草蝕紋病毒(Tobacco?etch?virus，以下稱為“TEV”)蛋白酶識別序列的復合標簽。另外，在非專利文獻2中記載了組合有蛋白A、鈣調蛋白結合肽(CBP)和TEV蛋白酶識別序列的復合標簽。但是，上述文獻中記載的TEV蛋白酶識別序列，均只不過是為了將附加的標簽切去而使用的，并非作為用于TEV蛋白酶識別序列自身的檢測和純化的標簽而使用。如果蛋白酶識別序列本身能夠作為檢測和純化用的標簽使用，則能夠飛躍性地簡化構建體的設計。

現有技術文獻

非專利文獻

非專利文獻1：David?S.Waugh，Making?the?most?of?affinity?tags.TRENDS?in?Biotechnology?Vol.23No.6?June?316-320(2005)

非專利文獻2：Oscar?Puig，et?al.，The?Tandem?Affinity?Purification(TAP)Method：A?General?Procedure?of?Protein?Complex?Purification.METHODS?24，218-229(2001)

發明內容

本發明的目的在于提供能夠用于蛋白酶識別序列本身的檢測和純化的標簽肽，并且提供利用該標簽肽和針對該標簽肽的抗體的重組蛋白的純化方法。此外，本發明的目的還在于提供由該標簽肽和第二標簽肽組合而成、能夠同時結合兩種抗體的標簽肽。

為了解決上述課題，本發明包含以下的發明。

[1]一種標簽肽，具有蛋白酶識別序列，其特征在于，該蛋白酶識別序列與針對該標簽肽的抗體的表位重疊。

[2]一種標簽肽，具有蛋白酶識別序列，其特征在于，該蛋白酶識別序列與針對該標簽肽的抗體的表位重疊，該蛋白酶識別序列為煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識別序列。

[3]如上述[1]或[2]所述的標簽肽，其特征在于，具有以下的氨基酸序列(1)：

(1)RX₁X₂LYX₃QGKDG(序列號1)

(X₁、X₂和X₃相同或不同，表示任意的氨基酸殘基)。

[4]如上述[3]所述的標簽肽，其中，氨基酸序列(1)為以下的氨基酸序列(2)：

(2)RENLYFQGKDG(序列號2)。

[5]一種標簽肽，其特征在于，由上述[1]～[4]中任一項所述的標簽肽和第二標簽肽組合而成。

[6]如上述[5]所述的標簽肽，其特征在于，能夠同時結合針對上述[1]～[4]中任一項所述的標簽肽的抗體和針對第二標簽肽的抗體。

[7]一種多核苷酸，其特征在于，編碼上述[1]～[6]中任一項所述的標簽肽。

[8]一種重組載體，其特征在于，含有上述[7]所述的多核苷酸。

[9]針對上述[1]～[4]中任一項所述的標簽肽的抗體。

[10]如上述[8]所述的抗體，其為由大鼠-小鼠雜交瘤2H5(FERM?BP-11245)產生的單克隆抗體。

[11]大鼠-小鼠雜交瘤2H5(FERM?BP-11245)。

[12]一種蛋白的純化方法，其中，包括下述(i)～(iii)的步驟：

(i)使上述[9]或[10]所述的抗體與含有上述[1]～[4]中任一項所述的標簽肽和目標蛋白的融合蛋白的試樣作用而形成融合蛋白與抗體的結合物的步驟；

(ii)使洗脫物質與上述(i)的步驟中得到的結合物作用而使融合蛋白從抗體中游離的步驟；