[發明專利]重組人α1-抗胰蛋白酶

有效

• 申請號: 201080017593.2
• 申請日: 2010-04-20
• 公開（公告）號: CN102439037A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: E·C·M·布林克曼;C·E·哈克;I·范德尼烏文霍弗
• 申請（專利權）人: 克魯塞爾荷蘭公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

本發明涉及醫藥產品領域，具體是涉及重組人α1-抗胰蛋白酶，該酶尤其可用于α1-抗胰蛋白酶缺乏相關肺氣腫的預防和/或治療。?

發明背景?

α1-抗胰蛋白酶(AAT)或α1-蛋白酶抑制劑(α1PI)是由活化嗜中性粒細胞釋放的蛋白酶天然抑制劑。AAT是由394個氨基酸組成的糖蛋白，并具有52kD的分子量。人AAT表達為418個氨基酸的前體，其中24個氨基酸的前體被切除以產生394個氨基酸的終產物。AAT主要在肝臟中合成，但也顯示了其在嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞中的表達。?

由于嗜中性粒細胞蛋白酶在肺中不可抗及破壞性的作用，低或零血漿AAT水平構成了肺氣腫發生的一個風險因子。已經開發了AAT增加療法用于AAT缺乏相關肺氣腫的預防和/或治療(Mulgrew等人，2007)。?

目前，用高劑量的血漿來源(pd)AAT(60mg/kg/周；來自Talecris的Prolastin、來自Baxter的Aralast以及來自ZLB的Zemaira)治療患有AAT缺乏相關肺氣腫的患者。為了緩解AAT缺乏相關肺氣腫，需要大量及頻繁的AAT注射。對血漿來源材料的主要擔憂是制備物的安全性。與所有的人源材料一樣，pdAAT潛在的風險為朊病毒或其它外來物質的污染。第二個擔憂是血漿材料有限的可得性。?

人血漿來源AAT在第46、83和247位的Asn殘基含有三個N-連接聚糖。這些聚糖主要由二觸角和三觸角結構組成。重組蛋白質上的聚糖的高度唾液酸化對最優的藥物動力學(PK)具重要性。?

至今在大多數重組平臺中的低表達限制了AAT的重組生產(Karnaukhova等人，2006)。重組AAT已在轉基因系統中高水平地產生，但是因為其不理想的藥物代謝動力學(PK)及由于非人污染的安全性問題，其臨床開發已被停止(Spencer等人，2005)。?

因此存在著對有活性的、能足量獲取的并具有有用的藥物動力學特性的重組人AAT的需求。?

發明概述?

根據本發明，已經顯示具有適宜的藥物動力學譜的重組人α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)可以在PER.C6細胞中大量產生。?

在導致了本發明的研究中，在無血清條件下產生了表達人AAT且共表達α-2，3-唾液酸轉移酶(ST3)或α-2，6-唾液酸轉移酶(ST6)的細胞系。該細胞系能夠表達高水平的rhAAT。因此，達到了多達每細胞每天(pcd)22皮克rhAAT的產量。重要的是，本發明的rhAAT顯示了其具有作為嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的活性。對聚糖譜的分析顯示了良好的唾液酸覆蓋(cap)總體程度。有趣的是，與血漿來源AAT(Prolastin)相比，注意到本發明的rhAAT中四觸角型聚糖的增加。此外，與血漿來源AAT相比，在共表達ST3的細胞中產生的rhAAT在大鼠中顯示了增加的平均殘留時間(MRT)。而與血漿來源AAT相比，在共表達ST6的細胞中產生的rhAAT顯示了減少的平均殘留時間。?

一方面，本發明因此提供了包含N-連接聚糖的重組人α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，其中：?

(a)所述N-連接聚糖的至少10％為四觸角型聚糖；和?

(b)在所述N-連接聚糖上唾液酸覆蓋的程度(Z/A)為至少50％。?

在另一個實施方案中，所述N-連接聚糖的至少20％為四觸角型聚糖。?

在另外的實施方案中，在所述四觸角型N-連接聚糖上唾液酸覆蓋的程度為至少30％。?

在另外的實施方案中，所述N-連接聚糖上總唾液酸化的至少50％為α-2，3-唾液酸化。優選的，所述N-連接聚糖上總唾液酸化的至少90％為α-2，3-唾液酸化。?

另一方面，本發明提供了制備物和藥物組合物，其包含所述rhAAT，以及任選地一或多種藥物學可接受的賦形劑。?

另一方面，本發明涉及所述rhAAT、包含所述rhAAT的制備物和/或藥物組合物在預防和/或治療尤其是AAT-相關的肺氣腫和/或具有嗜中性粒細胞介導的組織損傷的炎癥性疾病中的用途。?

在另外的實施方案中，本發明提供了用于產生重組人α1-抗胰蛋白酶的方法，其包括以下步驟：給PER.C6細胞提供編碼人α-1抗胰蛋白酶的?核酸以使得所述PER.C6細胞含有可表達形式的所述核酸；在有助于所述重組人AAT產生的條件下培養所述PER.C6細胞，其中所述PER.C6細胞被修飾為共表達α-2，3-唾液酸轉移酶或α-2，6-唾液酸轉移酶。?

附圖簡述?